一种脱氮型活性污泥微生物胞内一氧化氮原位测定的方法与流程

本发明涉及污水生物处理领域，提供一种脱氮型活性污泥微生物胞内一氧化氮(NO)原位测定的方法。

背景技术：

生物脱氮过程包括硝化过程和反硝化过程，在生物反硝化过程中会产生NO中间产物。NO对微生物作用存在不同论断，一方面NO是无色无味且难溶于水的有毒气体，对微生物会有一定的毒害作用；但另一方面NO是真核生物体内重要的活性分子，在微生物体内也发挥着重要作用，例如在过氧化氢压力下保护微生物细胞、提高微生物耐药性等。关于脱氮微生物胞内NO对微生物作用的研究可能为脱氮型活性污泥的生理特性提供新的思路，因此对脱氮型微生物胞内NO的研究具有重要意义。

然而目前对NO的检测技术还存在不足之处，尤其是对脱氮型活性污泥中不同种类微生物NO产生情况及对反硝化作用影响的技术相对缺乏，开发一种脱氮型活性污泥微生物胞内一氧化氮原位测定的方法来研究脱氮型活性污泥微生物在反硝化过程中的作用及不同种类微生物在此过程中的NO贡献情况十分必要。

技术实现要素：

针对上述现象不足之处，本发明提供一种脱氮型活性污泥微生物胞内一氧化氮(NO)原位测定的方法，该方法可以对所有脱氮型污泥进行微生物胞内NO的原位测定，以此来确定反硝化过程中NO变化情况及NO在不同微生物细胞中的分布情况，本方法为分析各菌群对反硝化功能分析提供一种脱氮型活性污泥微生物胞内一氧化氮原位测定的优化方案。

一种脱氮型活性污泥微生物胞内一氧化氮原位测定的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)、选取未膨胀的脱氮型污泥或已膨胀的脱氮型污泥作为目标污泥，分析其特征情况；

(2)、用1*PBS清洗目标泥三次，并用1*PBS稀释至原本泥量，去除脱氮型污泥中其他杂质的干扰；

(3)、未膨胀的脱氮型污泥微生物胞内一氧化氮原位测定的方案为：吸取步骤(2)1-10μL样品均匀地涂在事先用明胶包被好的玻片上的每个well孔中，涂片量同样以刚好平铺实际玻片上well孔为准，并在室温下晾干；在避光条件下，取1-20μL浓度为1-50μmol/L的DAF-FM DA(NO荧光探针)添加到涂有样品的每个well孔中，DAF-FM DA添加量以探针液包被住well孔中污泥；将样品放置于20-37℃恒温条件下静置5-20分钟后取出，在避光条件下用1*PBS洗涤玻片三次，将未进入微生物细胞的DAF-FM DA(NO荧光探针)液去除，并置于室温下晾干，加入抗荧光衰减剂，并用指甲油密封，进行后续荧光原位检测；

或已膨胀的脱氮型污泥微生物胞内一氧化氮原位测定的方案为：在避光条件下，先将稀释好的1-50μmol/L的DAF-FM DA(NO荧光探针)与步骤(2)样品等体积混合，混匀后置于0-4℃条件下静置5-20分钟，后再吸取1-10μL加有DAF-FM DA的样品均匀平铺涂在事先用明胶包被好的玻片每个well孔中(涂片量以刚好平铺实际玻片上well孔为准)，并置于室温下晾干，加入抗荧光衰减剂，并用指甲油密封，进行后续荧光原位检测。

未膨胀的脱氮型污泥的SVI值小于150mL/g，已膨胀的脱氮型污泥的SVI值大于150mL/g。

DAF-FM DA的溶液优选为1*PBS。

该方法可以对正常的未膨胀污泥及膨胀脱氮型污泥都可以进行微生物胞内NO的原位测定，以此来确定反硝化过程中NO变化情况及NO在不同微生物细胞中的分布情况，本方法为分析各菌群对反硝化功能分析提供一种脱氮型活性污泥微生物胞内一氧化氮原位测定的优化方案。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

(1)本发明提供的一种脱氮型活性污泥微生物胞内一氧化氮(NO)原位测定的方法，对正常的未膨胀污泥及膨胀污泥都可以进行微生物胞内NO的原位测定，以此来确定反硝化过程中NO变化情况及NO在不同微生物细胞中的分布情况。

(2)该发明提供的一种脱氮型活性污泥微生物胞内一氧化氮(NO)原位测定的方法，和一氧化氮反应形成的荧光产物受pH值的影响小，其产生的荧光更加稳定，不容易淬灭且其检测敏感度高。

(3)该发明提供的一种脱氮型活性污泥微生物胞内一氧化氮(NO)原位测定的方法，后期可以和膨胀污泥丝状菌原位杂交试验相结合，探究具体丝状菌中对NO及反硝化作用的影响。

附图说明

图1(1a-1d)为本发明脱氮型无膨胀活性污泥微生物胞内一氧化氮荧光原位图(1000倍)；

图2(2a-2d)为本发明脱氮型膨胀活性污泥微生物胞内一氧化氮荧光原位图(1000倍)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方法对本发明作进一步详细说明，但本发明并不限于以下实施例。

实施例1

1、选取实验室中未膨胀的和已膨胀的脱氮型污泥作为目标污泥，将未膨胀脱氮型污泥标记为1号样片，膨胀的脱氮型污泥标记为2号样品；

2、分别分析1号和2号样品的特征：1号和2号样品的污泥浓度分别为3000mg/L和2500mg/L，SVI值分别为65mL/g和281mL/g，总氮去除率分别为55.3％和68.6％；

3、用1*PBS清洗目标泥三次，并用1*PBS稀释至原本泥量，去除污泥中其他杂质的干扰；

4、将1号样品混匀后均分为4份，分别标记为A、B、C和D样品；

5、在避光条件下，将原有的DAF-FM DA(NO荧光探针)在20℃水浴温育片刻至全部融解后，将其浓度稀释为10μmol/L。

6、分别取1mL的A和B样品置于5mL的离心管中，在避光条件下，添加等体积稀释好的DAF-FM DA(NO荧光探针)，轻轻混匀。将A样品置于4℃冰箱，B样品放置于37℃恒温箱中，静置20分钟后取出。

7、在避光条件下，用10μL枪头分别吸取上过探针的A和B样品均匀平铺涂在事先用明胶包被好的玻片每个well孔中，涂片量以刚好平铺实际玻片上well孔为准，本试验涂片量为3-5μL，并在室温下晾干；

8、用10μL枪头分别吸取C和D样品均匀的涂在事先用明胶包被好的玻片上的每个well孔中，涂片量同样以刚好平铺实际玻片上well孔为准，本试验涂片量为3-5μL，并在室温下晾干；

9、在避光条件下，分别取10μL DAF-FM DA(NO荧光探针)添加到涂有C和D样品的每个well孔中，其添加量以探针液包被住well孔中污泥为宜，本试验中添加量为10μL。将C样品置于4℃冰箱，D样品放置于37℃恒温箱中，静置20分钟后取出。

10、在避光条件下将C和D样品用1*PBS洗涤玻片三次，将未进入微生物细胞的DAF-FM DA(NO荧光探针)液去除，并置于室温下晾干；

11、待A、B、C和D样品都处理完毕后，分别对各样品加入抗荧光衰减剂，并用指甲油密封，放置于荧光显微镜下进行观察拍照，图(1a-1d)分别对应未膨胀A、B、C和D样品。

12、对不同条件下的NO显微镜照片进行比对分析，得出最优的脱氮型无膨胀活性污泥微生物胞内一氧化氮原位测定的方案为：吸取3-5μL样品均匀地涂在事先用明胶包被好的玻片上的每个well孔中，涂片量同样以刚好平铺实际玻片上well孔为准，并在室温下晾干；在避光条件下，取10μL DAF-FM DA(NO荧光探针)添加到涂有样品的每个well孔中，其添加量以探针液包被住well孔中污泥为宜。将样品放置于37℃恒温静置20分钟后取出后在避光条件下用1*PBS洗涤玻片三次，将未进入微生物细胞的DAF-FM DA(NO荧光探针)液去除，并置于室温下晾干，荧光照片(图1-d)显示脱氮型微生物胞内NO分布均匀；

13、将2号样品按照3-12的步骤进行分析，得出最优的脱氮型膨胀活性污泥微生物胞内一氧化氮原位测定的方案为：在避光条件下，先将稀释好的10μmol/L的DAF-FM DA(NO荧光探针)与样品等量混合，轻轻混匀后置于4℃条件下静置20分钟，后再吸取3-5μL样品均匀平铺涂在事先用明胶包被好的玻片每个well孔中(涂片量以刚好平铺实际玻片上well孔为准)，并在室温下晾干，荧光照片显示即使在丝状菌体内(图2-a)也有NO产生并广泛分布，其中图(2a-2d)分别对应已膨胀A、B、C和D样品。。

凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。