一种免疫检测试剂条的制作方法

技术领域

本发明直接属于一种检测被分析物质的试剂条，特别地，属于一种检测被分析物质的横向流动试剂条。

背景技术：

分析可以被执行来同时或分别检测一个或多个样品中被分析物。分析可以是定量检测来提供一个被分析物质存在样品中的数量。或者，分析可以是定性检测来提供被分析物是否存在样品中。

典型的横向流动分析试剂条包括多孔的样品接受垫，与接受垫处于液体流通的标记物质垫和与标记物质垫液体流通的测试试剂条。有时候，标记物质垫包括干的标记物质，它包括被颗粒标记的抗体。测试试剂条具有检测区域，它包括以固定形式存在的结合被分析物质或被分析物质的拟态物质的物质。使用检测装置的时候，液体样品被施加在样品接受垫上。样品移动到包含有干的标记物质的标记物质垫上。样品和可移动的标记物质一起移动到试剂条上的检测区域上，这样液体样品中的被分析物质是否存在就可以被检测。例如美国专利号5,451,504,5,707,818,6,121,008,6,699,722,和7,393,697。

在这样的检测系统中，一旦被检测的流体样本(液体)被滴加到样本垫上，液体在层析作用力下(毛细作用)自动沿着横向试剂条向下游流动，带动干的标记物质(例如金标记抗体或抗原)向下移动，在检测区域上与固定在检测区域上的物质，例如抗体或抗原进行反应，最终在检测区域上显示出检测结果。由于流体在流动的同时需要完成反应，同时需要获得检测结果。这就需要对传统的试剂条进行改进，提检测的各个方面的性能。

技术实现要素：

在传统的试剂条上，常常需要对添加的样本的量进行设计，例如最大体积和最小体积样本的规定，这为该技术的发展带来了局限。当非专业人士进行操作的时候，如果不需要对样本的体积做严格的要求，可以大大提高免疫检测试剂条的家庭或非专业人士的使用。

本发明为了解决传统试剂条上的一些缺陷，提供一种全新的试剂条，可以对样本的量或体积不进行严格的控制，就能获得理想的检测结果。

一方面，本发明提供一种免疫检测试剂条，其特征在于，该试剂条包括支持流体流动的载体，该载体包括：干的标记物质和检测区域，其中，在干的标记物质的上游包括减缓液体样本流动的试剂。减缓液体流动的试剂让滴加在标记物质的上游的液体样本可以短暂相对的停留一段时间或者让液体样本缓慢释逐渐释放，这样可以让液体样本与干的标记物质充分均匀的接触，减缓干的标记物质的释放，这样可以让标记物质缓慢释放到液体中去。特别的，当标记物质的量很多的时候，这样效果更加明显。

在一些优选的方式中，减缓液体样本流动的试剂是一些表面活性活性试剂。优选的，在干的标记物质的上游包括样本接收区域，样本接受区域位于载体上，所述的疏水性试剂或表面活性试剂被包括在样本接收区域上。在一些优选的方式中，在样本垫上处理一些让标记垫的载体变为相对疏水的试剂。所述的试剂为表面活性试剂。这里指的“相对”的含义是指没有处理试剂和处理有试剂的相对比较而言。例如，没有处理试剂的时候，样本接收垫表现为100％的亲水，而处理有表面活性试剂的疏水性试剂或让表面活性试剂的浓度降低，让100％的亲水的样本接收垫变得相对疏水些。或者，在一些方式中，样本接收区域的材料本身是100％疏水性的材料或实质上为疏水性材料，在这个方式中，可以通过处理亲水性试剂，让1疏水性的材料成为亲水性材料。在一些优选的方式中，处理的亲水性表面活性试剂为S-7；S-17；Tween20；TritonX-100；S-13，其中他们的浓度为小于或等于0.1％；小于或等于0.09％；小于或等于0.05％。优选的为0.009％，优选的为0.004％，0.003％,0.009％,0.005％。

在一些优选的方式中，标记物质的OD值大于150，优选的，大于200，可以是200,230,220,250,280,300。优选的，标记物质被处理在两个标记垫上，标记物质可以被处理在多个标记垫，标记垫可以是两个，三个或三个以上。当标记物质被处理在多个标记垫上的时候，多个标记垫可以重叠放置在载体上，也可以是两个标记垫的边缘相互重叠放置。因为当标记物质的很多的时候，如果处理在一个标记垫上，该标记点不能承载所有的标记物质，就算能够承载，需要经过复杂的处理程序，这样才能让单个标记垫吸收所有的标记物质并且能够在短暂的时间对标记物质进行充分的释放。为了更好的让标记垫承载大量的标记物质和充分释放，我们把标记物质处理在多个标记垫上，这样可以满足用一个样本，可以一次性检测多个被分析物质的目的；例如在检测区域上包括多个检测区域，每一个检测区域对应不同的被分析物质。

在另一些优选的方式中，在对疏水性的聚酯膜上处理低浓度的表面活性试剂的时候，把表面活性试剂溶解在挥发性的有机溶液(例如酒精、甲醛、乙醇)中，然后再处理再聚酯膜上。如果表面活性剂的浓度过低，也可以则需要借助物理强迫力(如超声波等)才能将溶液顺利处理到疏水性的聚酯膜上，例如用超声波的时候，把聚酯膜放置在处理的溶液中，然后对溶液和聚酯膜进行超声。这里所说的低浓度的表面活性试剂一般是指那些浓度小于0.5％,0.45％,0.35％,0.1％的试剂，优选的是小于0.1％的表面活性试剂，浓度可以是小于或等于0.09％；小于或等于0.05％。优选的为0.009％，优选的为0.004％，0.003％,0.009％,0.005％。表面活性试剂的种类可以是S-7；S-17；Tween20；TritonX-100；S-13。

有益效果

在外销唾液产品的开发过程中，我们发现：在临床试验中出现较高比例的“花板”(如图1)，尤其是那些金标使用量很高的多合一试纸条产品，如THC/OPI/AMP，像这样的产品经常加喷多次金标到标记垫上，总金标OD能够达到200以上，如果再结合不合适的样本添加量(通常是过量的情况下)，很容易对金标的释放会造成不小的影响(金标的释放落在样本层析前锋的后面，或者简单理解成金标“来不及”释放)，轻则出现C/T线上下位置“泛白”，重则出现如图这样的“花板”。针对这一问题，我们通过优化样本垫，使样本在接触样本垫时不会第一时间就被吸收，而是有一个短暂的停留过程，从而使样本的第一波层析速度不至于过快，使金标垫有充分的时间释放，降低不正常释放的比例。

附图说明

图1为传统免疫测试条出现花板的结果示意图；

图2和图3为本发明具体实施方式中试剂条的立体结构示意图；

图2所示，这些试剂条101一般包括标记区域121和检测区域131，其中标记区域的上游可以包括样本接受区域111。在检测区域131上包括显示检测结果的区域和位于检测区域下游的检测结果对照区域。通常，这些试剂条的样本接受区域包括样本接受片111，标记区域包括标记片121，在样本接收区域上包括完成反应所必须的试剂，检测区域包括检测片131，如图3所示，在检测片131上包括显示测试结果的一个或多个区域206、205、207和位于该区域132下游的检测结果控制对照区域208

详细说明

载体

载体可以为多孔渗水或非渗水表面。多孔渗水表面可以为薄膜，例如检测试剂流动的吸水性材料。纸或纸浆产品，玻璃纤维，聚合物，例如硝酸纤维，尼龙都可以被用来作为本装置的吸水材料。在一个方式中，被吸水的材料也可以被用做载体。非吸水性材料可以用于在两个表面之间产生毛细作用让流体沿着检测装置流动。

载体可以提供检测装置上多个区域之间的流体交换。这些区域可以是标记区域或检测区域。这些区域可以被设置在检测装置的一些面板上，也可以被设置在检测装置的一边之上或/和下面的位置。例如，标记区域可以位于检测区域之上。任何三维结构安排这些区域都可以被运用到本发明描述的装置中来。在载体上还可以设置液体样本接收区域，液体样本接收区域上可以处理一些物质，例如缓冲试剂、过滤试剂以及其试剂来减少液体样本中的干扰物质的试剂。当液体样本区域为亲水性的时候，可以处理一些疏水性试剂，让样本区域变得比较疏水。

亲水或疏水试剂

在载体上处理一些合适的亲水或疏水试剂，让载体相对变得更疏水，让液体样本停留一端时间或者延缓液体样本流动。这些试剂是常用的表面活性试剂。表面活性剂(surfactant)，是指具有固定的亲水亲油基团，在溶液的表面能定向排列，并能使表面张力显著下降的物质。表面活性剂的分子结构具有两亲性：一端为亲水基团，另一端为憎水基团；亲水基团常为极性的基团，如羧酸、磺酸、硫酸、氨基或胺基及其盐，也可是羟基、酰胺基、醚键等；而憎水基团常为非极性烃链，如8个碳原子以上烃链。表面活性剂分为离子型表面活性剂和非离子型表面活性剂等。当载体为亲水性的时候，可以处理疏水性表面活性试剂，让载体变得更疏水些，如果载体为疏水性的时候，可以稍微处理亲水试剂。在一些优选的方式中，当载体为疏水的时候，处理很低浓度的亲水试剂，让疏水载体变得稍微亲水，例如处理的表面活性试剂的浓度为0.01-0.005％；0.004％，0.005％或0.05％。处理亲水表面活性试剂的种类可以为任何亲水性表面活性试剂，例如可以为S-7；S-17；Tween20；TritonX-100；S-13，其中他们的浓度为小于或等于0.04％。优选的为小于或等于0.009％，优选的为小于或等于0.004％，小于或等于0.003％,小于或等于0.009％,小于或等于0.005％。

检测区域

标记区域上的标记物质可以结合(直接地或者间接地)目标被分析物，从而在样品流过基质时，被分析物质就被标记上了可以检测地标记物质。检测区域还包含可以结合被分析物相关位点的试剂。这种位点物质可能是被分析物自身的或者结合被分析物的一种试剂(例如，一种试剂可以在被分析物通过试剂区时与被分析物结合)的一种免疫学上的抗原决定基。在各种具体方案中，和被分析物结合的试剂可以是一种抗体，一种抗体的片断或者部分，一种和结合到检测区域的抗体不同种类的抗体的衍生物(或者其中的片断)，或者特异性结合对的另一个成分，例如，抗生物素蛋白，链霉菌抗生物素蛋白，或者可以和结合被分析物的半体相结合的生物素。

在另一个具体方案中，检测区域是一沿着试验条纵轴的纬度方向分布的条状物，其中包含一种被分析物的特异性结合分子，或者是结合被分析物的分子复合物。在一些具体方案中，标记是一种有色颗粒，可能是右旋糖苷颗粒，金溶胶或者其它被标记的颗粒，这些标记可以是提供可检测的信号的任何合适的标记。

标记区域

被分析物的特异性结合分子携带有试剂区的标记。当特异性的结合分子捕获被分析物而且被标记了的被分析物在检测区域被结合的时候，由于标记物在这里积聚这个区就可以观察到。“特异性的结合分子”是指和被分析物相结合并且不能和样品中的其它任何分子牢固结合的结合分子。被分析物的特异性的结合分子也可以和表明样品中被分析物的存在或者与被分析物的存在相关联的分子相结合。牢固结合是指结合达到改变试验结果或者使试验结果不明显的程度。在一些具体方案中，特异性的结合分子可能是一种抗体或者一种抗体片段(例如，一种抗体的Fab区)，一种抗原，一种结合配体的受体或者受体的片段，或者生物素－链霉菌抗生物素蛋白结合对的一个成分或者其它类型的结合对.

这样试剂区就可以提供标记，当样品流过试剂区的时候，被分析物结合了可以产生可检测信号的标记。“标记区块”是指基质上含有标记样品中可能存在的被分析物的物质的部位。因此一个试剂区就是一个标记区块。“标记”可以是产生可检测信号的任何合适的标记。例如，标记可以是可溶性颗粒，荧光颗粒，化学发光颗粒，金属或者合金(例如，胶体金)，或者囊，特别是包含可见染料的脂质体。疏水溶胶也是有用的，疏水的有机染料或者色素在水中不可溶或者只有很有限的一小部分可溶。标记还可以是聚合体颗粒，例如有色的聚苯乙烯颗粒(例如，球状的)。其它有用的颗粒状的标记包括铁蛋白，藻红蛋白，藻胆素－蛋白，沉淀的或者可溶性的金属或者合金，真菌，海藻，或者细菌的色素或衍生物，例如细菌的叶绿素或者其它的植物原料。在某些具体方案中，标记是有色颗粒，例如右旋糖苷颗粒。在其它的具体方案中，用作阳性对照的标记和染料选择相同的颜色，以加强两种信号在基质上或者基质内产生单一的明显的符号时的相互作用。

在其它的具体方案中，标记可能是被分析物的一种被标记了的特异性结合分子(例如，一种抗体)。例如，在一个具体方案中，目标被分析物是人绒毛膜促性腺激素(hCG)，结合hCG的标记是金溶胶标记的抗hCG抗体。当样品到标记区块时，样品中的hCG被金溶胶标记的抗hCG抗体结合。标记抗体并不干扰检测区域的捕获分子和标记的hCG相结合。例如，标记可以结合被分析物的一个部分，而捕获分子可以结合被分析物的另一个部分或者结合标记。hCG-抗-hCG抗体-金复合物移动到基质的下游。当复合物到达检测区域时和捕获分子相结合形成金-抗-hCG抗-hCG-抗-hCG抗体。捕获分子可能是hCG的另一种特异性结合分子，或者是结合hCG被分析物的半体的特异性结合分子。当金-抗-hCG特异性结合分子-hCG-抗-hCG特异性结合分子复合物结合到检测区域时，检测区域被复合物上的金标记着色并且在检测区域金标记变得肉眼可见。在一个具体方案中，特异性的结合分子是抗体或者抗体片段。标记和捕获结合分子能够结合被分析物上不同的抗原决定部位，在一个具体方案中，标记的特异性结合分子结合了β-hCG，而捕获结合分子结合了α-hCG。

“抗体”是指免疫球蛋白，无论是天然的还是部分或者全部合成的。这个术语还包括其中保持结合能力的抗体的衍生物，也包括任何含有与免疫球蛋白的结合域同源的或者很大程度上同源的结合域的蛋白质。这些蛋白质可能是源自天然物质，也可能是部分或者全部合成的。一种抗体可能是单克隆的或者是多克隆的。一种抗体可能是任何免疫球蛋白类型中的一员，包括任何人类的免疫球蛋白类型：IgG,IgM,IgA,IgD,IgG和IgE。“抗体片段”是抗体的衍生物或者抗体的小于全长的一个部分。抗体片段能够保留至少一个全长抗体的结合能力的显著位点。抗体片断的例子包括Fab,Fab',F(ab')₂,scFv,Fv,dsFv二聚体,和Fd碎片，但是不仅仅包括以上这些。

抗体片段可以由任何方式生成。例如，抗体片段可以通过酶解或者化学裂解一个完整的抗体来生成，或者也可以通过从编码部分抗体序列的基因重组。换句话说，抗体片段可以部分地或者全部地重组产生。抗体片段可以是任意的单链抗体片段。换句话说，抗体片段可以包含多条相互联结的肽链，例如，通过二硫键相联结。抗体片段也可以是任意的一种多分子复合物。一个有功能的抗体片段通常包含至少大约50个氨基酸，而更多的抗体片段通常包含至少大约200个氨基酸。

单链Fvs(scFvs)是重组的抗体片段，它仅由可变轻链(V_L)和可变重链(V_H)相互以多肽链共价结合。V_L和V_H中一方具有胺基端区域。多肽链长度和组成是可变的，其长度可以使两个可变域相互桥联并且对原子的排列没有严重影响。多肽链通常主要由甘氨酸和丝氨酸残基延伸构成，其中有一些谷氨酸和赖氨酸残基散在分布以增加其溶解度。“二聚体”是指单链Fvs的二聚物。二聚体的单体包含的肽链通常比大多数单链Fvs的短，并且它们显示出形成二聚物的倾向。

“Fv”片段由一个V_H和一个V_L域以非共价相互连接组成。术语“dsFv”在这里是指包含一个稳定V_H-V_L对的分子间二硫键的Fv。“F(ab')₂”片段是抗体的一个片段，本质上和用胃蛋白酶在pH 4.0-4.5时消化免疫球蛋白(通常是IgG)得到的片段相同。这个片段也可以重组合成。“Fab'”片段是一种抗体片段，本质上和通过减少F(ab')₂片段上的两条重链相互连接的双硫键得到的片段相同。Fab'片段也可以重组合成。“Fab“片段是一种本质上和用木瓜蛋白酶消化免疫球蛋白(通常IgG)得到的片段相同的抗体片段。Fab片段也可以重组合成。Fab片段上的重链片段是Fd碎片。

被分析物的类型

能够用本发明稳定检测的被分析物的例子包括(但是不仅仅包括)人绒毛膜促性腺激素(hCG)，黄体生成素(LH)，卵巢刺激素(FSH)，丙肝病毒(HCV)，乙肝病毒(HBV)，乙肝表面抗原，艾滋病病毒和任何滥用的药物。被分析物能够在任何的液体或者液化样品中检测到，例如尿液，唾液，口水，血液，血浆，或者血清。其它的被分析物的例子还有肌氨酐酸，胆红素，亚硝酸盐，蛋白质(非特异性的)，血液，白细胞，血糖，重金属和毒素，细菌成分(例如，特定类型的细菌的特殊的蛋白质和糖分，例如大肠杆菌0157:H7，金黄色葡萄球菌，沙门氏菌，产气荚膜梭菌，弯曲杆菌，单核增生李斯特菌，肠炎弧菌，或者腊状芽孢杆菌)。任何其它的适合侧流试验形式的被分析物都可以用本装置检测。

样本的类型

任何类型的样品都能够用本发明的装置进行试验，包括体液(例如，尿液和其它体液，以及临床样品)。液体样品可能源自固体的或者半固体的样品，包括粪，生物组织和食物样品。这些固体的和半固体的样品可以通过任何适合的方法转变成液体样品，例如在一种适当的液体中混合，跺碎，浸软，孵育，溶解或者酶解固体样品(例如，水，磷酸盐缓冲液或者其它缓冲液)。“生物样品”包括源自活的动物、植物和食物的样品，也包括尿液、唾液、血液和血液成分、脑脊液、阴道拭子，精液、粪便、汗液、分泌物、组织、器官、肿瘤、组织和器官的培养物，细胞培养物和那里的条件介质，不管是人的还是动物的。食物样品包括加工过的食物成分和最后的产品，肉，奶酪，酒，牛奶和饮用水。植物样品包括源自任何植物、植物组织、植物细胞培养物和那里的条件介质的样品。“环境样品”是那些源自环境的样品(例如，湖水样品或者其它水体的样品，污水样品，土壤样品，地下水样品，海水样品，废物废水的样品)。污水和相关的废物也可以包含在环境样品中。

具体实施方式

实验 为了更加详细的阐述本发明的检测装置，现给以实验说明。

实验1：用检测装置检测唾液中是否存在一定浓度的冰毒，k粉和吗啡。

第一部分：本发明的试剂条和检测装置的组装和部件制作

如图2所示的试剂条101用来说明本实验所用本发明的试剂条的部件和制作方法。例如图2和图3所示，这些试剂条101一般包括标记区域121和检测区域131，其中标记区域的上游可以包括样本接受区域111。在检测区域131上包括显示检测结果的区域和位于检测区域下游的检测结果对照区域。通常，这些试剂条的样本接受区域包括样本接受片111，标记区域包括标记片121，在样本接收区域上包括完成反应所必须的试剂，检测区域包括检测片131，在检测片131上包括显示测试结果的一个或多个区域206、205、207和位于该区域132下游的检测结果控制对照区域208，一般检测结果区域为线条状，在检测结果区域上显示颜色变化来表示样本中被分析物质是否存在；吸水区域包括吸水片141，这些部件111，121，131，141首尾相连让液体可以从试剂条的一端沿着箭头所指的方向流向另一端完成测试。一般常用的试剂条为硝酸纤维素膜试剂条，即检测区域131包括硝酸纤维素膜，在硝酸纤维素膜上固定特异结合分子来显示检测的结果(207,206的区域上)；还可以是醋酸纤维素膜或尼龙膜等等。

硝酸纤维素膜的处理。检测片131为硝酸纤维素膜(NC)，在硝酸纤维素膜上有四条线条，一个是检测线205、206和207，位于检测线下游的检测结果控制线208。在其中一条检测线上固定连接有BSA的大麻分子；一条检测线上固定连接有BSA的吗啡分子；一条检测线上固定连接有BSA的安非他明分子；在检测结果控制线上固定羊抗兔IgG。固定的方法可以用自动喷膜处理机器来自动处理，其中在处理检测线条的浓度为0.3毫克/毫升，稀释缓冲液体为磷酸缓冲液(PBS)；在检测结果控制线上固定羊抗兔IgG抗体；浓度为0.3毫克/毫升，稀释缓冲液体为磷酸缓冲液(PBS)。把处理好的硝酸纤维素膜放在37℃烘箱里烘干即可。

标记片121的处理。标记片为聚脂膜，被胶体金颗粒标记好的兔IgG、抗大麻抗体、抗吗啡抗体和抗安非他明抗体被处理在聚脂膜上。在标记垫上进行两次喷量，处理的标记溶液的OD值超过200，稀释溶液为1倍PBS缓冲溶液，其中还含有1％的BSA。在标记片上还处理有胶体金标记的兔IgG抗体。把处理好的标记片放在37℃烘箱里烘干即可。

样本接受片111的处理。样本接受片为疏水性的聚酯膜，在该膜上处理的溶液为：Borax(0.07M/L)；Tween20(0.005％)；Cholic Acid(1％)；Tris(0.1M)。把处理好的样本接受片放在37℃烘箱里烘干即可。其中作为多个平行试验，在相同的聚酯膜上，处理吐温20的浓度为0.75％(不需要有机溶剂)，0.04％(溶解在70％的酒精中)和0.005％(溶解在70％的酒精中)。

一般，在对疏水性的聚酯膜上处理低浓度的表面活性试剂的时候，把表面活性试剂溶解在挥发性的有机溶液(例如酒精、甲醛、乙醇)中，然后再处理再聚酯膜上。如果表面活性剂的浓度过低，也可以则需要借助物理强迫力(如超声波等)才能将溶液顺利处理到疏水性的聚酯膜上，例如用超声波的时候，把聚酯膜放置在处理的溶液中，然后对溶液和聚酯膜进行超声。

试剂条的组装。把处理好的各个部件按照图2所示的样子组装，让样本接受片位于标记片的上游，标记片位于检测片和样本接受片之间，在检测片的下游放置吸水的滤纸。这些部件都放置在一个非吸水性的支撑片上。

通过临床试验，获得的结果如下：

从以上结果可以明显看出，当在疏水性的聚酯膜上处理不同浓度的表面活性试剂后，让样本接收垫的疏水性发生了改变，越是低亲水性的聚酯膜，发生花板等不正常的数量越少。经过另外类似的实验，发现，如果不处理任何表面活性试剂，液体样本不能进行流动，几乎不进行检测。这样的处理，不会对试剂条的特异性和灵敏度产生不利的影响。

实验2：用一条检测试剂条检测唾液中是否存在一定浓度的THC/OPI/AMP。

本实验的处理方式与实验1不同之处：在硝酸薄膜上的检测线条分别是THC/OPI/AMP，在聚酯膜的样本垫上处理的是S-9，浓度分别为0.75％(对照)，0.04％和0.005％。在进行检测的时候，每个试剂条递交5毫升的唾液样本。

所取得的实验结果见下表：

从以上结果可以明显看出，当在疏水性的聚酯膜上处理不同浓度的表面活性试剂后，让样本接收垫的疏水性发生了改变，越是低亲水性的聚酯膜，发生花板等不正常的数量越少。经过另外类似的实验，发现，如果不处理任何表面活性试剂，液体样本不能进行流动，几乎不进行检测。这样的处理，不会对试剂条的特异性和灵敏度产生不利的影响。

另外，本发明人通过对其他类似的不同液体样本，例如尿液，血液等样本进行实验，同时对其他类似的表面活性试剂进行过实验，发现S-7；S-17；Tween20；TritonX-100；S-13(一种疏水性的表面活性剂,当被处理的载体为亲水的时候)，浓度基本上在<＝0.05％情况下表现为“低亲水性”，这样可以改善液体样本的流动性，特别在标记物质OD很高的时候特别有效，而不会影响检测条的其他性能，例如灵敏度和特异性(具体实验数据略)。