一种胰岛素的测定试剂及其制备方法与流程

本发明涉及一种胰岛素的测定试剂及其制备方法，属于借助于测定材料的化学或物理性质来测试或分析材料
技术领域：
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背景技术：
：胰岛素是一种蛋白质类激素。体内胰岛素是由胰岛β细胞分泌的。在人体十二指肠旁边，有一条长形的器官，叫做胰腺。在胰腺中散布着许许多多的细胞群，叫做胰岛。胰腺中胰岛总数约有100～200万个。胰岛素合成的控制基因在第11对染色体短臂上。基因正常则生成的胰岛素结构是正常的；若基因突变则生成的胰岛素结构是不正常的，为变异胰岛素。在B细胞的细胞核中，第11对染色体短臂上胰岛素基因区DNA向mRNA转录，mRNA从细胞核移向细胞浆的内质网，转译成氨基酸相连的长肽--前胰岛素原，前胰岛素原经过蛋白水解作用除其前肽，生成胰岛素原。胰岛素原随细胞浆中的微泡进入高尔基体，由86个氨基酸组成的长肽链--胰岛素原在高尔基体中经蛋白酶水解生成胰岛素及C肽，分泌到B细胞外，进入血液循环中。未经过蛋白酶水解的胰岛素原，一小部分随着胰岛素进入血液循环，胰岛素原的生物活性仅及胰岛素的5％。胰岛素的分子量5700，由两条氨基酸肽链组成：A链有21个氨基酸，B链有30个氨基酸；A-B链之间有两处二硫键相连；胰岛B细胞中储备胰岛素约200U，每天分泌约40U。空腹时，血浆胰岛素浓度是5～15μU/mL；进餐后血浆胰岛素水平可增加5～10倍。胰岛素的生物合成速度受血浆葡萄糖浓度的影响，当血糖浓度升高时，B细胞中胰岛素原含量增加，胰岛素合成加速。临床证明：胰岛素检查，可以判定糖尿病患者是1型患者还是2型患者，因此，主要适合于没有使用胰岛素治疗的患者，具体如下：(1)1型糖尿病患者多在5μU/ml以下，2型患者血浆胰岛素水平可正常、偏低或高于正常。增高明显者呈高胰岛素血症，提示有胰岛素抵抗。在进行OGTT的同时测定血浆胰岛素浓度，了解胰岛β细胞功能，以鉴别1型糖尿病和2型糖尿病。1型糖尿病患者空腹和糖刺激后胰岛素水平均较低，呈低平曲线；2型糖尿病患者可表现为胰岛素分泌高峰延迟或增高，胰岛素分泌的第一时相降低或缺如，和同时相的血糖值相比，胰岛素分泌偏低。亦可同时测定血清C肽以加以鉴别。血浆胰岛素降低尚可见于嗜铬细胞瘤、生长抑素瘤、醛固酮增多症、原发性甲状旁腺功能减退症等所引起的继发性糖尿病和胰岛B细胞瘤、胰外肿瘤、肾上腺功能减退及垂体功能低下等所致的低血糖症。目前国内测定胰岛素的方法主要有：(1)酶联免疫法，该方法定量准确性差，操作时间长，一般只用于定性检测。(2)放射免疫法，该方法线性范围窄，灵敏度低。(3)电化学发光法，该方法虽然准确度比较高，但标记物是大分子，免疫结合空间大，标记物对测试结果影响较大。基于此，做出本申请。技术实现要素：针对现有胰岛素在测试过程中存在的上述缺陷，本发明首先提供一种快速灵敏、准确性好、特异性高、稳定性好、液体双试剂操作简便，采用国内外先进的胶乳增强免疫比浊法，适用于临床全自动或半自动生化分析(手工加样品、试剂)的胰岛素测定试剂。为实现上述目的，本申请采取的技术方案如下：一种胰岛素的测定试剂，由R1试剂和R2试剂构成，所述的R1试剂是添加有缓冲液的纯化水中所形成的溶液；所述的R2试剂是添加有胰岛素单克隆抗体胶乳颗粒悬浊液的纯化水中所形成的溶液。进一步的，作为优选：所述的R1试剂中，缓冲液为Tris缓冲液，更优选的，所述的Tris缓冲液的浓度为100mmol/L。所述的R2试剂中，胰岛素单克隆抗体胶乳颗粒悬浊液的浓度为1mg/mL。同时，本申请还提供了一种具有上述特征胰岛素测定试剂的制备方法，包括如下步骤：(1)R1试剂配制：向纯化水中加入缓冲液，搅拌至完全溶解；后定容；(2)R2试剂配制：向纯化水中加入胰岛素单克隆抗体胶乳颗粒悬浊液，搅拌至完全溶解后定容；(3)对上述制备的R1试剂和R2试剂进行灵敏度、线性范围、精密度和准确度进行测定。进一步的，作为优选：所述的搅拌速度为450转/分。搅拌速度过高会导致剪切力过大，影响所配制溶体的表面张力和粘合力，搅拌速度过低则影响其混配效果，控制在450转/分时，在确保搅拌剪切适中的同时，也促进了其内所添加物质的融合。步骤(1)中，所述的纯化水初始体积为800ml，定容体积为900ml。定容前后体积变化在10-15％，可以很好的保证其内所添加其他物质良好的融合性，确保所配置的R1试剂浓度、溶液稳定性最佳。步骤(2)中，所述的纯化水初始体积为200ml，定容体积为300ml。定容前后体积变化在40-50％，可以很好的保证其内所添加其他物质良好的融合性，确保所配置的R2试剂浓度、溶液稳定性最佳。R1试剂的溶液密度会较R2试剂溶液密度小，在确保R2中胰岛素单克隆抗体胶乳颗粒悬浊液浓度的同时，R2试剂的整体体积较R1体积小，确保R2试剂与R1试剂达到良好的配伍效果，有利于测试稳定性和精确性的提高。本发明的工作原理如下：胰岛素测定试剂盒是将抗体标记在纳米级胶乳的表面，血清中的胰岛素与试剂中的抗体在液相中相遇，即结合成抗原-抗体复合物，产生一定浊度，胶乳颗粒可以相应的增大该浊度变化。通过与相应的标准曲线做对照，可以由浊度变化计算得出血清中胰岛素的浓度。(1)灵敏度评价试验根据GB/T26124-2011《临床化学体外诊断试剂(盒)》中对“分析灵敏度”检测的要求，以试剂盒在规定参数下对分析灵敏度评价用样本进行检测产生的吸光度改变，换算为n单位的吸光度的差值(ΔA)作为分析灵敏度。分析灵敏度评价试验对分析灵敏度评价用样本重复测定20次。评估结果：分析灵敏度50μIU/ml吸光度差值(ΔA)≥0.125ABS。(2)线性范围评价试验根据GB/T26124-2011《临床化学体外诊断试剂(盒)》和《体外诊断试剂分析性能评估指导原则——线性范围(征求意见稿)》中的建议，对试剂线性范围进行验证时，在待验证线性范围内选择5个浓度水平，每个浓度水平重复测定3次。(3)精密度评价试验精密度评价包括重复性和批间差，且至少评估二个浓度水平样本的精密度，其中有一个浓度在医学决定水平左右。因此，重复性评价采用在重复性条件下，用二个浓度水平的控制物质(其中一个浓度接近医学决定水平)测试，每个浓度重复测试10次；批间差评价采用二个浓度水平的控制物质(其中一个浓度接近医学决定水平)分别测试3个不同批号的试剂盒，每个批号测试3次。(4)准确度评价试验用不少于40个在检测浓度范围内的不同浓度的人源样品，以指定的分析系统作为比对方法，每份样品按待测试剂操作方法及比对方法分别检测。用线性回归方法计算两组结果的相关系数(r)及每个浓度点的相对偏差。评估结果：三批试剂的重复性变异系数CV≤5％；相对偏差≤10％，试剂线性可达100μIU/ml，分析灵敏度50μIU/ml吸光度差值(ΔA)≥0.125ABS。本发明利用胶乳增强免疫比浊法测定胰岛素的方法，其优点是快速灵敏，准确性好，特异性高，稳定性好，操作简便，可适用于临床全自动或半自动生化分析仪配套使用。附图说明图1为本申请中抗原-吸光度曲线图；图2为本申请中抗体-吸光度曲线图；图3为本申请中测定试剂的准确度柱状图。具体实施方式实施例1本实施例所用主要试剂：R1试剂：Tris缓冲液：100mmol/L。R2试剂：胰岛素单克隆抗体胶乳颗粒悬浊液：1mg/mL。1)R1试剂的配制①将800ml纯化水加入到适当容器中。②开启电动搅拌器，搅拌速度均为450转/分。③称取10.95gTris加入上述纯化水中，搅拌至完全溶解。④搅拌十分钟以上。⑤定容至900ml。2)R2试剂的配制①将200ml纯化水加入到适当容器中。②开启电动搅拌器，搅拌速度均为450转/分。③称取0.12g胰岛素单克隆抗体胶乳颗粒悬浊液加入上述纯化水中，搅拌至完全溶解。④搅拌十分钟以上。⑤定容至300ml。3)试剂检验①仪器配置:仪器使用日立7100全自动生化分析仪。测定参数严格按照产品说明书在仪器中设定，基本测定参数如下：a.方法：终点法，反应方向：向上；波长：600nm，温度37℃。b.比色杯光径：1cm；R1试剂:200μl,R2试剂:40μl，胰岛素标准样：8μl。c.第一测光点：在R2加入后1分钟读取。d.第二测光点：在R2加入后5分钟读取。②试剂外观检查：目测检查。③装量检查：用通用量具测量。④试剂空白测定:用蒸馏水或去离子水作为空白样品测试试剂盒，在测试主波长下，记录测试启动时吸光度(A1试剂)和约5分钟后的吸光度(A2试剂)，A2即为工作试剂的空白吸光度。⑤线性范围测定:取接近线性范围上限的高值样本用生理盐水倍比稀释配制成不同浓度梯度的样本系列。以H值与稀释比例计算出预期值。稀释方法参照表1所示(根据高值的大小可相应调整稀释梯度)。表1样本稀释表实施例12345生理盐水(ml)00.50.50.50.5高值标本H(ml)10.50.50.50.5稀释比例原倍1/21/41/81/16实施例1样本的浓度为已知定值CH，实施例2-5样本浓度按公式：样本浓度＝CH×稀释比例，计算作为预期值，将稀释好的样本系列充分混匀，在校正后的测定系统上按从低值到高值顺序平行测定2次，均值作为对应实施例样本实测值(如2次测定结果有明显偏差应剔除重测)。统计学分析：以预期值为横坐标，样本实测值为纵坐标作图及直线回归分析，确定线性区间计算出直线方程y＝a+bx及相关系数，当相关系数r≥0.990时为线性良好。数据分析处理采用MicrosoftExcel软件。相关公式如下：式中，C：浓度；V：容积；b：回归线的斜率；∣a∣：回归线截距的绝对值；r：相关系数；Xi：各管预期值；Yi：各管测定值；i：1、2、3.……、n；n：测定样本数。⑥精密度测定:a.重复性测定:用临床标本或质控血清测试试剂盒，重复测试10次，计算测量值的平均值和标准差(s)。按如下公式计算变异系数(CV)。与变异系数CV(％)：式中：——待测血清样本的均值；Xi——测定血清样本的测定结果；n——测定次数；CV——变异系数。b.批间差测定取三个批号送检试剂，每个批号取3瓶，分别测定1份临床样本或质控血清，可选用罗氏质控品，分别计算9份试剂测定均值和每个批号3份试剂的测定均值并用MicrosoftExcel软件统计三个批号试剂测定的变异系数。相关公式如下:式中：——中的最大值；——中的最小值；——总均值。⑦准确性测定:比对试验：相关系数r≥0.990，相对偏差≤10％。⑧分析灵敏度:用已知浓度或活性的样品测试试剂盒，记录在试剂盒规定参数下产生的吸光度改变，换算为n单位的吸光度差值(ΔA)。根据表1计算得到的预期值、实测值、变异系数CV、批间极差、相对偏差B以及吸光度差值ΔA汇总入表2。表2测试结果汇总表表3分析灵敏度对照表(1-20为平行实验序号)表4批内重复性对照表表5批间精密度对照表评估结果及表2-5结果表明：本申请试剂的重复性变异系数CV≤5％；相对偏差≤10％，试剂线性可达100μIU/ml，分析灵敏度50μIU/ml吸光度差值(ΔA)≥0.125ABS。本申请利用胶乳增强免疫比浊法测定胰岛素的方法，其优点是快速灵敏，准确性好，特异性高，稳定性好，操作简便，可适用于临床全自动或半自动生化分析仪配套使用。以上内容是结合本发明创造的优选实施方式对所提供技术方案所作的进一步详细说明，不能认定本发明创造具体实施只局限于上述这些说明，对于本发明创造所属
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的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明创造的保护范围。当前第1页1 2 3