一种基于核酸适体的人胰岛素检测方法与流程

本发明涉及一种检测人胰岛素的方法，特别涉及一种基于核酸适体快速检测人胰岛素的法；属于生物纳米领域。

背景技术：

胰岛素是胰脏中胰岛细胞分泌的一种蛋白质激素，既能促进血液中的葡萄糖进入肝、肌肉和脂肪等组织细胞，在细胞内合成糖元或转变成其它营养物质贮存起来；又能促进葡萄糖氧化分解释放能量，供机体利用，是维持血糖在正常水平的主要激素。胰岛素分泌不足或缺乏时，会引起高血糖，甚至是糖尿病。同时人胰岛素也是作为胰岛瘤和创伤的标志物。因此，能否准确测定血液中胰岛素的浓度，对高血糖及糖尿病的早期诊断、临床和基础研究具有重要的价值。人胰岛素检测方法包括免疫分析法、色谱法、电化学分析法和荧光分析法，这几种方法操作繁琐，耗时，成本高，难以应用到现场即时检测。因此发明一种能快速检测人血液中胰岛素的含量，且灵敏性高，易于操作，并能特异性识别人胰岛素的方法就显得尤为重要。

技术实现要素：

针对现有技术存在的缺陷，本发明的目的是在于提供一种操作简单、快速、低成本的通过比色法检测人胰岛素的方法。

为了实现上述技术目的，本发明提供了一种基于核酸适体的人胰岛素检测方法，该方法包括以下步骤：

1)先通过柠檬酸钠还原氯金酸制备纳米金；

2)再将人胰岛素适配体修饰在所述纳米金表面，得到探针；

3)将一系列不同浓度的人胰岛素标准液先分别与所述探针反应，再分别与NaCl溶液反应，各所得反应液分别通过紫外检测纳米金聚集态及分散态的紫外吸收峰值，建立人胰岛素浓度值对应纳米金聚集态紫外吸收峰值和纳米金分散态紫外吸收峰值比率的标准曲线；

4)将含人胰岛素的待测液按3)步骤通过紫外检测，并依据标准曲线进行分析，即得待测液中人胰岛素的浓度。

本发明的技术方案，主要是基于纳米金处于分散状态时，在518nm左右有其独特的吸收峰，而当纳米金聚集时，其在518nm左右的吸收峰发生会红移，且会在685nm左右出现新的吸收峰，其峰的大小代表聚集的程度，同时会发生变色反应(溶液颜色也会随之由酒红色变成蓝色，可以通过肉眼分辨)。而本发明的技术方案，将人胰岛素适配体吸附在纳米金上构成探针，当人胰岛素存在时，会与纳米金上吸附的人胰岛素适体结合，形成G-四联体结构，使得纳米金的耐盐性降低，使纳米金聚集，因此可以通过紫外测定待测液中纳米金聚集态685nm左右吸收峰值与纳米金518nm左右吸收峰值的比值，可以实时表征标志物的浓度。

优选的方案，纳米金尺寸为13nm～15nm。

较优选的方案，所述的纳米金的制备过程为：所述纳米金的制备过程为：将浓度为0.005～0.015wt％氯金酸溶液加热至沸腾后，加入浓度为1.5～2.5wt％的柠檬酸钠溶液进行反应，溶液由无色变为紫色再变为酒红色，在酒红色的状态下保持沸腾15～20分钟，在搅拌条件下冷却至室温，即得纳米金；其中，氯金酸与柠檬酸钠的质量比为1∶3～5。通过优选的方案能获得粒径均一的纳米金。

优选的方案，将人胰岛素适体与纳米金在室温下反应，得到探针。较优选为：将人胰岛素适体与纳米金按50～80nM∶2～5nM的比例，在25℃～40℃温度下反应10～15分钟，得到探针。优选的技术方案中，探针表面的人胰岛素适体修饰量易于调控。可以通过简单调节孵育过程中人胰岛素适配体浓度，以及适体与纳米金的反应比例，来实现适体在纳米金表面的结合量，易于使适体在纳米金表面的结合量达到最大化。

优选的方案，将浓度为50pM、250pM、500pM、1nM、10nM、50nM、100nM、150nM和200nM的人胰岛素标准液分别与探针反应15～20min，再分别与50～100mM的NaCl溶液反应10～15min后，分别采用紫外检测人胰岛素标准溶液中纳米金聚集态及分散态的紫外吸收峰值，并建立人胰岛素浓度值对应纳米金聚集态紫外吸收峰值和纳米金分散态紫外吸收峰值比率的标准曲线。

优选的方案，人胰岛素适配体为血液中人胰岛素特异性结合的适配体。

本发明的方法采用人胰岛素适配体来作用于相应的人胰岛素，具有更高的特异性和识别力，检测的灵敏度更高。

本发明方案中采用的人胰岛素适配体可以通过现有的常规方法筛选方法获得，或者直接通过购买得到，如生工生物工程上海(股份)有限公司。

本发明方案中采用的人胰岛素适配体无任何修饰，主要通过静电力吸附结合于制备的纳米金表面。

相对现有技术，本发明技术方案带来的有益技术效果：

1)本发明的技术方案根据颜色的变化，可以直接通过肉眼来大致判断人胰岛素含量的多少，可以采用比色法精确测定人胰岛素浓度，达到快速检测人胰岛素的目的。

2)本发明的技术方案构建的探针采用的是血液中人胰岛素对应的适配体，没有干扰物质，检测限低，具有特异性识别，检测灵敏度更高。

3)本发明的技术方案探针的制备及用于人胰岛素检测过程简单、重复性好，操作简单。探针仅采用一种核酸分子链，且无修饰成分，相对于使用具有巯基，信号分子等修饰的适体而言，成本很低。

4)本发明的构建的探针为纳米金与适配体的复合物，适体直接捕捉目标物，因此可直接用来检测标志物。

5)本发明的技术方案以人胰岛素适配体(aptamer)来作用于人胰岛素，同时根据溶液的紫外曲线来分析血液中人胰岛素的含量，具有灵敏度高、检出限低、特异性强的特点。

6)本发明技术方案采用的适体序列可变，适体更换序列后可以推广到检测相对应的其他标志物，如多肽，DNA，RNA，使得传感器能得到更广泛的应用，具有一定的普遍性。

附图说明

【图1】为本发明检测人胰岛素的原理示意图；

【图2】为检测不同浓度标志物的紫外图；

【图3】为通过紫外检测人胰岛素标准液建立人胰岛素浓度值对应纳米金聚集态紫外吸收峰值和纳米金分散态紫外吸收峰值比率(A₆₈₅/A₅₁₈)的标准曲线。

具体实施方式

以下实施例旨在进一步说明本发明内容，而不是限制本发明权利要求的保护范围。

实施例1

(1)纳米金制备，及其纳米金与适体结合制备探针，步骤如下：

首先将100mL 0.01％氯金酸在搅拌下，加热至沸腾，然后迅速往沸腾的溶液中加入2mL 2％柠檬酸钠溶液，继续搅拌使之混合均匀，此时搅拌不宜过于剧烈，以免混合不均匀，同时保持继续沸腾状态，当颜色由无色变为紫色再变为酒红色时，开始计时，继续加热15min，然后把溶液从油浴锅中拿出，放置磁力搅拌器上搅拌冷却至室温，然后利用紫外分光光度计以及粒径分析仪进行纳米金溶液粒子尺寸和分散程度的表征。

(2)建立标准曲线：分别配制不同浓度(0.05，0.25，0.5，1，10，50，100，150，200nM)的人胰岛素，分别依次加入到以上构建的纳米金与适体构成的探针溶液中，由于探针溶液中的适配体是对应的人胰岛素的aptamer，它能够和人胰岛素形成稳定的G-四联体结构，会将纳米金上吸附的人胰岛素适体竞争下来。由于加入人胰岛素的量不同，形成的G-四联体的量也不同，将纳米金上吸附的人胰岛素适体竞争下来的量也不同，当加入70mM NaCl时，会使纳米金有一定的聚沉，从而整个溶液会呈现不同的颜色，可以通过肉眼快速判断人胰岛素的大致含量，再测紫外吸收曲线，685nm的吸收峰强度与518nm处吸收峰强度的比值也会不一样，从而可以准确定量分析人胰岛素。

(3)对人胰岛素的定量分析步骤如下：当用于检测实际样品时，可通过用实际样品代替标准溶液，进行上述的相同操作步骤，计算紫外吸收峰比率，根据线性标准曲线即可得出样品对应的浓度。

从图2可以看出随着加入的人胰岛素的量增加，685nm处吸收峰值与518nm处吸收峰值的比值逐渐增大。也可以看出Au-aptamer-insulin在50～100mM NaCl下的状态，对应紫外可见吸收光谱中吸收峰的大小。

从图3可以看出在一定的浓度范围内人胰岛素浓度越大，其A₆₈₅与A₅₁₈的比值越来越大，达到某一浓度后会趋于平衡，从插图中可以看出：在低浓度范围内有很好的其线性关系。