一种康复新液及其半成品中总氨基酸含量的检测方法与流程

本发明涉及氨基酸检测技术领域，尤其涉及一种康复新液及其半成品中总氨基酸含量的检测方法。

背景技术：

康复新液是一种外科常用药，其原料为美洲大蠊。康复新液在临床上被广泛应用于烧伤、烫伤、战伤、创面感染及顽固性溃疡、褥疮等，使用简便易行，疗效较好，该单品种产品市场销量很好。康复新液产品富含丙氨酸、亮氨酸和缬氨酸等18种氨基酸，因此总氨基酸含量是产品质量的主要评估指标之一。康复新液半成品即康复新液待灌液和成品康复新液均需对总氨基酸含量进行质量控制，由于其中的丙氨酸含量比重最大，故以丙氨酸作为总氨基酸含量的评估标准。

现有的康复新液中总氨基酸含量的检测方法包括以下步骤：对照品溶液的制备：精密称取在105℃干燥至恒重的丙氨酸对照品50mg，置于100mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀；精密量取5mL稀释摇匀后的溶液，置于100mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得。标准曲线的建立：精密量取所述对照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分别置于10mL具塞试管中，加水至1mL；然后依次加入0.2mol/L枸橼酸缓冲液(pH5.0)1.0mL、1％抗坏血酸溶液0.1mL、茚三酮乙二醇甲醚试液3.0mL，摇匀，置于沸水浴中加热15分钟，取出，放冷；再加入80％乙醇3.0mL，摇匀，采用紫外分光光度法试验，在570nm波长处分别测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。待测品的测定：精密量取康复新液待测品2mL，置于100mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀；精密量取1mL稀释摇匀后的溶液，置于10mL具塞试管中，然后依次加入0.2mol/L枸橼酸缓冲液(pH5.0)1.0mL、1％抗坏血酸溶液0.1mL、茚三酮乙二醇甲醚试液3.0mL，摇匀，置于沸水浴中加热15分钟，取出，放冷；再加入80％乙醇3.0mL，摇匀，在570nm波长处测定紫外吸收度，从所述标准曲线上读出待测品溶液中氨基酸的含量，计算，即得。国家标准规定：康复新液成品每1mL含总氨基酸以丙氨酸(C₃H₇NO₂)计，不得少于0.72mg。

现有的标准曲线法可检测出康复新液或其半成品(康复新液半成品每1mL含总氨基酸以丙氨酸(C₃H₇NO₂)计，不得少于0.77mg)中总氨基酸的含量，以判断是否合格。但是，该检测方法操作复杂，检测耗时较长(一般在2h以上)，影响生产周期。

技术实现要素：

有鉴于此，本申请提供一种康复新液及其半成品中总氨基酸含量的检测方法，本申请提供的检测方法能定性检测总氨基酸的含量，操作简便、检测时长较短，生产周期较短。

本申请提供一种康复新液半成品中总氨基酸含量的检测方法，包括以下步骤：

提供浓度为0.0154mg/mL的丙氨酸对照品溶液；

将康复新液半成品待测品用水稀释，稀释后的待测品与茚三酮溶液进行反应，得到预处理的待测品；同时将所述丙氨酸对照品溶液与所述茚三酮溶液同样进行反应，得到预处理的对照品；

目视比较所述预处理的待测品和预处理的对照品的颜色，得到康复新液半成品中总氨基酸含量。

优选地，所述茚三酮溶液为茚三酮乙二醇甲醚试液。

优选地，所述稀释后的待测品与茚三酮溶液的反应在缓冲液和抗坏血酸溶液存在的条件下进行；

所述缓冲液不含与茚三酮反应的基团，且所述缓冲液的pH值为5～7。

优选地，所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液、邻苯二甲酸盐缓冲液或枸橼酸类缓冲液。

优选地，所述待测品稀释倍数为50倍，稀释后的待测品的用量为1mL；

所述缓冲液的pH值为5，浓度为0.2mol/L，用量为2mL～20mL；

所述抗坏血酸溶液的质量浓度为1％，用量为0.1mL；

所述茚三酮溶液的用量为3mL。

优选地，所述稀释后的待测品与茚三酮溶液的反应通过在沸水浴中加热实现。

优选地，所述加热的时间为5min～10min。

优选地，所述在沸水浴中加热后还包括：在冷水浴中放冷，分别得到预处理的待测品和预处理的对照品。

本发明还提供一种康复新液中总氨基酸含量的检测方法，包括以下步骤：

提供浓度为0.0144mg/mL的丙氨酸对照品溶液；

将康复新液待测品用水稀释，稀释后的待测品与茚三酮溶液进行反应，得到预处理的待测品；同时将所述丙氨酸对照品溶液与所述茚三酮溶液同样进行反应，得到预处理的对照品；

目视比较所述预处理的待测品和预处理的对照品的颜色，得到康复新液中总氨基酸含量。

与现有技术相比，本申请提供的康复新液半成品中总氨基酸含量的检测方法包括以下步骤：提供浓度为0.0154mg/mL的丙氨酸对照品溶液；将康复新液半成品待测品用水稀释，得到稀释后的待测品；所述稀释后的待测品与茚三酮溶液进行反应，得到预处理的待测品；将所述丙氨酸对照品溶液与稀释后的待测品同时同法操作，得到预处理的对照品；目视比较所述预处理的待测品和预处理的对照品的颜色，得到康复新液半成品中总氨基酸含量。本申请利用康复新液半成品中总氨基酸与茚三酮的显色反应，以及该显色反应在属于可见光区的570nm波长有最大吸收，直接通过肉眼观察，比较待测品与对照品的颜色深浅，从而检测得到康复新液半成品中总氨基酸含量是否合格，耗时在15min以内。因此，本申请提供的检测方法无需紫外可见光分光仪器，可排除仪器的限制，操作简便，能大大缩短检测时间，同时其准确性和重复性也符合生产对总氨基酸含量检测的要求。尤其地，本申请能实现快速有效的车间在线监控。

同理，本申请提供的康复新液中总氨基酸含量的检测方法也具有操作简便和检测时间较短等特点。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1为实施例1预处理的待测品和对照品的颜色比较图；

图2为比较例2预处理的待测品和对照品的颜色比较图；

图3为比较例3预处理的待测品和对照品的颜色比较图；

图4为实施例2预处理的待测品和对照品的颜色比较图；

图5为实施例3预处理的待测品和对照品的颜色比较图。

具体实施方式

下面对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

本申请提供了一种康复新液半成品中总氨基酸含量的检测方法，包括以下步骤：

提供浓度为0.0154mg/mL的丙氨酸对照品溶液；

将康复新液半成品待测品用水稀释，稀释后的待测品与茚三酮溶液进行反应，得到预处理的待测品；同时将所述丙氨酸对照品溶液与所述茚三酮溶液同样进行反应，得到预处理的对照品；

目视比较所述预处理的待测品和预处理的对照品的颜色，得到康复新液半成品中总氨基酸含量。

本申请提供了一种总氨基酸含量(康复新液及其半成品)的快速检测技术，是一种限度检验法，效率高，适用于车间在线监控。

针对康复新液半成品中总氨基酸要求控制在0.77mg/mL以上，本申请实施例制备成浓度为0.0154mg/mL的丙氨酸对照品溶液。所述丙氨酸对照品的来源可为中国药品生物制品鉴定所(140680-201002)，含量为100.0％。所述丙氨酸对照品溶液要求具有稳定性，62天内含量不发生显著变化。

本申请实施例精密量取康复新液半成品待测品，置于量瓶中用水稀释至刻度，摇匀，得到稀释后的待测品。

在本申请中，所述待测品稀释倍数优选为50倍，如精密量取待测品2mL，置于100mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，得到稀释后的待测品。本申请实施例精密量取稀释后的待测品1mL，置于纳氏比色管中。

得到稀释后的待测品后，本申请实施例加入茚三酮溶液进行反应，得到预处理的待测品；同时将所述丙氨酸对照品溶液与所述茚三酮溶液同样进行反应，得到预处理的对照品。

本申请加入茚三酮溶液，利用康复新液半成品中总氨基酸与茚三酮的显色反应进行总氨基酸含量的检测。在本申请的实施例中，所述茚三酮溶液为茚三酮乙二醇甲醚试液。本申请对所述茚三酮溶液的来源没有特殊限制，具体的，所述茚三酮乙二醇甲醚试液的配制方法包括：取2.5g茚三酮，加入50mL乙二醇甲醚使溶解，另取浓度为0.01mol/L的氰化钾溶液5mL，用乙二醇甲醚稀释至250mL，将上述茚三酮乙二醇甲醚溶液和氰化钾乙二醇甲醚溶液这两种溶液混匀，放置24小时即得试液，所述试液在2℃～8℃于暗处保存，储存一周待用；所述茚三酮乙二醇甲醚试液的用量可为3mL。

在本发明的优选实施例中，所述稀释后的待测品与茚三酮溶液的反应在缓冲液和抗坏血酸溶液存在的条件下进行，得到预处理的待测品。其中，所述抗坏血酸溶液的质量浓度优选为1％，用量优选为0.1mL。

所述缓冲液一般不含与茚三酮反应的基团如胺基等，且所述缓冲液的pH值优选为5～7；所述缓冲液优选自磷酸盐缓冲液、邻苯二甲酸盐缓冲液或枸橼酸类缓冲液如枸橼酸缓冲液。在本申请的优选实施例中，所述缓冲液的pH值为5，浓度可为0.2mol/L，能使后续目视比色更加明显；所述缓冲液的用量可为2mL～20mL，优选为4mL～10mL，更优选为6mL～8mL，更方便后续目视比色。

在本申请的一个实施例中，所述缓冲液为磷酸二氢钾-氢氧化钠溶液，pH值为6.8，配制方法可为：把25mL 0.2mol/L的磷酸二氢钾与23.6mL 0.1mol/L氢氧化钠混合均匀，加水稀释至100mL。在本申请的一个实施例中，所述缓冲液为pH值为5的磷酸盐缓冲液，配制方法可为：取0.2mol/L磷酸二氢钠溶液一定量，用氢氧化钠试液调节pH值至5，即得。在本申请的一个实施例中，所述缓冲液为pH值为5.6的邻苯二甲酸盐缓冲液，配制方法可为：取邻苯二甲酸氢钾10g，加水900mL，搅拌使溶解，用氢氧化钠试液(必要时用稀盐酸)调节pH值至5.6，加水稀释至1000mL，混匀，即得。在本申请的一个实施例中，所述缓冲液为pH值为5.8的磷酸盐缓冲液，配制方法可为：取磷酸二氢钾8.34g与磷酸氢二钾0.87g，加水使溶解成1000mL，即得。在本申请的一个实施例中，所述缓冲液为pH值为5的枸橼酸缓冲液，浓度为0.2mol/L，用量为7mL。在本申请的一个实施例中，所述缓冲液为pH值为6.2的枸橼酸盐缓冲液，配制方法可为：取枸橼酸4.2g，加1mol/L的20％乙醇制氢氧化钠溶液40mL使溶解，再用20％乙醇稀释至100mL，即得；或者，取2.1％枸橼酸水溶液，用50％氢氧化钠溶液调节pH值至6.2，即得。在本申请的一个实施例中，所述缓冲液为pH值为6.5的磷酸盐缓冲液，配制方法可为：取磷酸二氢钾0.68g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液15.2mL，用水稀释至100mL，即得。在本申请的一个实施例中，所述缓冲液为pH值为6.6的磷酸盐缓冲液，配制方法可为：取磷酸二氢钠1.74g、磷酸氢二钠2.7g与氯化钠1.7g，加水使溶解成400mL，即得。

在本发明的优选实施例中，所述稀释后的待测品与茚三酮溶液的反应通过在沸水浴中加热实现，加热一定时间后取出反应容器，放冷，得到预处理的待测品。所述沸水浴为本领域技术人员所熟知的，温度为98℃～100℃；所述加热的时间优选为5min～10min。本申请减少了水浴时间，缩短了检测时间。本发明在沸水浴中加热后优选还包括：在冷水浴中放冷，得到预处理的待测品。本申请实施例将加热后的待测品取出，置于冷水浴中迅速放冷，也利于缩短检测时间。

本申请实施例精密量取所述丙氨酸对照品溶液，与稀释后的待测品同时同法操作，如同时将所述丙氨酸对照品溶液与所述茚三酮溶液同样进行反应，得到预处理的对照品。在此，对得到预处理的对照品的过程不作赘述。

得到预处理的待测品和预处理的对照品后，本申请实施例通过目视比较两者的颜色，判定得到康复新液半成品中总氨基酸含量的结果：如果预处理的待测品的颜色比预处理的对照品的颜色深，则该康复新液半成品待测品中总氨基酸含量符合规定；如果预处理的待测品的颜色比预处理的对照品的颜色浅，则该康复新液半成品待测品中总氨基酸含量不符合规定，需添加药材提取物等。

本发明还提供了一种康复新液中总氨基酸含量的检测方法，包括以下步骤：

提供浓度为0.0144mg/mL的丙氨酸对照品溶液；

将康复新液待测品用水稀释，稀释后的待测品与茚三酮溶液进行反应，得到预处理的待测品；同时将所述丙氨酸对照品溶液与所述茚三酮溶液同样进行反应，得到预处理的对照品；

目视比较所述预处理的待测品和预处理的对照品的颜色，得到康复新液中总氨基酸含量。

针对康复新液中总氨基酸要求控制在0.72mg/mL以上，本申请实施例制备成浓度为0.0144mg/mL的丙氨酸对照品溶液。除此之外，检测康复新液中总氨基酸含量的方法与上文所述的康复新液半成品的检测方法一致，在此不再赘述。

本申请提供的检测方法可以直接用肉眼比较颜色深浅，定性检测康复新液及其半成品中总氨基酸的含量，适用于车间在线监控，操作简单快捷，减少了对精密仪器的依赖度，大大缩短了检测时间；同时其准确性和重复性等都符合生产对总氨基酸含量检测的要求。

为了进一步理解本申请，下面结合实施例对本申请提供的康复新液及其半成品中总氨基酸含量的检测方法进行具体地描述。

以下实施例所用丙氨酸对照品的来源为中国药品生物制品鉴定所(140680-201002)，含量为100.0％；康复新液及康复新液半成品均为湖南科伦制药有限公司生产。

实施例1

精密称取丙氨酸对照品15.4mg，置于100mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀；再精密量取稀释后的对照品5mL，置于100mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得浓度为15.4μg/mL的丙氨酸对照品溶液。

精密量取康复新液半成品(批号为M150117)待测品2mL，置于100mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀；精密量取稀释后的待测品1mL，置于纳氏比色管中，依次加入0.2mol/L枸橼酸缓冲液(pH5.0)2.0mL、1％抗坏血酸溶液0.1mL、茚三酮乙二醇甲醚试液3.0mL，摇匀，置于沸水浴中加热10分钟，取出，置于冷水浴中迅速放冷，得到预处理的待测品(可称为甲管样品)。

精密量取所述丙氨酸对照品溶液1mL，置于纳氏比色管中，与稀释后的待测品同时同法操作，得到预处理的对照品(可称为乙管对照品)。

目视比较甲管样品和乙管对照品的颜色，参见图1，图1为实施例1预处理的待测品和对照品的颜色比较图。从图1可以看出，甲管样品的颜色深于乙管对照品的颜色，说明所述康复新液半成品待测品中总氨基酸含量在0.77mg/mL以上，符合规定。

并且，本实施例的检测时长在15min以内。

比较例1

精密称取在105℃干燥至恒重的丙氨酸对照品50mg，置于100mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀；精密量取5mL稀释摇匀后的溶液，置于100mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得。

标准曲线的建立：精密量取所述对照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分别置于10mL具塞试管中，加水至1mL；然后依次加入0.2mol/L枸橼酸缓冲液(pH5.0)1.0mL、1％抗坏血酸溶液0.1mL、茚三酮乙二醇甲醚试液3.0mL，摇匀，置于沸水浴中加热15分钟，取出，放冷；再加入80％乙醇3.0mL，摇匀，采用紫外分光光度法试验，在570nm波长处分别测定吸收度，以吸收度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

待测品的测定：精密量取实施例1中的康复新液半成品待测品2mL，置于100mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀；精密量取1mL稀释摇匀后的溶液，置于10mL具塞试管中，然后依次加入0.2mol/L枸橼酸缓冲液(pH5.0)1.0mL、1％抗坏血酸溶液0.1mL、茚三酮乙二醇甲醚试液3.0mL，摇匀，置于沸水浴中加热15分钟，取出，放冷；再加入80％乙醇3.0mL，摇匀，在570nm波长处测定紫外吸收度，从所述标准曲线上读出待测品溶液中氨基酸的含量。结果显示，所述康复新液半成品中总氨基酸含量为0.81mg/mL。

并且，本比较例的检测时长在2h以上。

比较例2

精密称取丙氨酸对照品15.4mg，置于100mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀；再精密量取稀释后的对照品5mL，置于50mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得浓度为30.8μg/mL的丙氨酸对照品溶液。

精密量取康复新液半成品(批号M150117)待测品2mL，置于50mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀；精密量取稀释后的待测品1mL，置于纳氏比色管中，依次加入0.2mol/L枸橼酸缓冲液(pH5.0)2.0mL、1％抗坏血酸溶液0.1mL、茚三酮乙二醇甲醚试液3.0mL，摇匀，置于沸水浴中加热10分钟，取出，置于冷水浴中迅速放冷，得到预处理的待测品(可称为甲管样品)。

精密量取所述丙氨酸对照品溶液1mL，置于纳氏比色管中，与稀释后的待测品同时同法操作，得到预处理的对照品(可称为乙管对照品)。

目视比较甲管样品和乙管对照品的颜色，参见图2，图2为比较例2预处理的待测品和对照品的颜色比较图。从图2可以看出，甲管样品的颜色与乙管对照品的颜色均过浅，难以判断所述康复新液半成品待测品中总氨基酸含量是否在0.77mg/mL以上。

比较例3

精密称取丙氨酸对照品15.4mg，置于100mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀；再精密量取稀释后的对照品5mL，置于200mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得浓度为7.7μg/mL的丙氨酸对照品溶液。

精密量取康复新液半成品(批号M150117)待测品2mL，置于200mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀；精密量取稀释后的待测品1mL，置于纳氏比色管中，依次加入0.2mol/L枸橼酸缓冲液(pH5.0)2.0mL、1％抗坏血酸溶液0.1mL、茚三酮乙二醇甲醚试液3.0mL，摇匀，置于沸水浴中加热10分钟，取出，置于冷水浴中迅速放冷，得到预处理的待测品(可称为甲管样品)。

精密量取所述丙氨酸对照品溶液1mL，置于纳氏比色管中，与稀释后的待测品同时同法操作，得到预处理的对照品(可称为乙管对照品)。

目视比较甲管样品和乙管对照品的颜色，参见图3，图3为比较例3预处理的待测品和对照品的颜色比较图。从图3可以看出，甲管样品的颜色与乙管对照品的颜色均过深，难以判断所述康复新液半成品待测品中总氨基酸含量是否在0.77mg/mL以上。

实施例2

精密量取康复新液半成品(批号为M150103)待测品2mL，置于100mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀；精密量取稀释后的待测品1mL，置于纳氏比色管中，依次加入0.2mol/L枸橼酸缓冲液(pH5.0)4.0mL、1％抗坏血酸溶液0.1mL、茚三酮乙二醇甲醚试液3.0mL，摇匀，置于沸水浴中加热8分钟，取出，置于冷水浴中迅速放冷，得到预处理的待测品(可称为甲管样品)。

精密量取实施例1中制备的丙氨酸对照品溶液1mL，置于纳氏比色管中，与稀释后的待测品同时同法操作，得到预处理的对照品(可称为乙管对照品)。

目视比较甲管样品和乙管对照品的颜色，参见图4，图4为实施例2预处理的待测品和对照品的颜色比较图。从图4可以看出，甲管样品的颜色浅于乙管对照品的颜色，说明所述康复新液半成品待测品中总氨基酸含量在0.77mg/mL以下，不符合规定，需添加药材提取物。

并且，本实施例的检测时长在15min以内。

比较例4

待测品的测定：精密量取实施例2中的康复新液半成品待测品2mL，置于100mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀；精密量取1mL稀释摇匀后的溶液，置于10mL具塞试管中，然后依次加入0.2mol/L枸橼酸缓冲液(pH5.0)1.0mL、1％抗坏血酸溶液0.1mL、茚三酮乙二醇甲醚试液3.0mL，摇匀，置于沸水浴中加热15分钟，取出，放冷；再加入80％乙醇3.0mL，摇匀，在570nm波长处测定紫外吸收度，从比较例1绘制的标准曲线上读出待测品溶液中氨基酸的含量。结果显示，所述康复新液半成品中总氨基酸含量为0.76mg/mL。

实施例3

精密称取丙氨酸对照品14.4mg，置于100mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀；再精密量取稀释后的对照品5mL，置于100mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得浓度为14.4μg/mL的丙氨酸对照品溶液。

精密量取康复新液(批号为M150203)待测品2mL，置于100mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀；精密量取稀释后的待测品1mL，置于纳氏比色管中，依次加入0.2mol/L枸橼酸缓冲液(pH5.0)7.0mL、1％抗坏血酸溶液0.1mL、茚三酮乙二醇甲醚试液3.0mL，摇匀，置于沸水浴中加热5分钟，取出，置于冷水浴中迅速放冷，得到预处理的待测品(可称为甲管样品)。

精密量取所述丙氨酸对照品溶液1mL，置于纳氏比色管中，与稀释后的待测品同时同法操作，得到预处理的对照品(可称为乙管对照品)。

目视比较甲管样品和乙管对照品的颜色，参见图5，图5为实施例3预处理的待测品和对照品的颜色比较图。从图5可以看出，甲管样品的颜色深于乙管对照品的颜色，说明所述康复新液待测品中总氨基酸含量在0.72mg/mL以上，符合规定。

并且，本实施例的检测时长在15min以内。

比较例5

待测品的测定：精密量取实施例3中的康复新液待测品2mL，置于100mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀；精密量取1mL稀释摇匀后的溶液，置于10mL具塞试管中，然后依次加入0.2mol/L枸橼酸缓冲液(pH5.0)1.0mL、1％抗坏血酸溶液0.1mL、茚三酮乙二醇甲醚试液3.0mL，摇匀，置于沸水浴中加热15分钟，取出，放冷；再加入80％乙醇3.0mL，摇匀，在570nm波长处测定紫外吸收度，从比较例1中绘制的标准曲线上读出待测品溶液中氨基酸的含量。结果显示，所述康复新液中总氨基酸含量为0.82mg/mL。

由以上实施例可知，本申请采用目视比色法，定性地检测得到康复新液及其半成品中总氨基酸含量，耗时在15min以内。本申请提供的检测方法操作简便，能大大减少检测时间，同时其准确性和重复性等都符合生产对总氨基酸含量检测的要求。