一种基于计数框的浮游藻类定量方法与流程

本发明涉及浮游藻类生态学领域，具体涉及一种基于计数框的浮游藻类定量方法。

背景技术：

随着城市和工业的快速发展，农业化肥和含磷洗涤剂的大量使用，不合理的开垦、放牧造成大面积的土壤侵蚀和退化，使得地表径流中营养物质含量大为提高，大量未经处理的城市生活污水和工农业用水流入湖泊和江河，水体氮、磷营养盐不断积累，水体富营养化进程被大大加速。浮游藻类的大量繁殖是水体富营养化的重要表征，在水体富营养化控制研究领域，浮游藻类的群落特征和演替规律既是研究对象，也是评价标准之一。目前，关于浮游藻类的群落调查研究主要分原位监测和取样实验室镜检两种。前者采用流式细胞仪等现场实时进行，所需仪器花费昂贵，同时针对复杂多样的藻类类群，需要事先建立庞大的数据库。因此绝大多数的藻类调查依然采用的是实验室镜检方法，为了使调查结果具有代表性，且尽可能的接近真实状态，除了随机采样、规范前处理如沉淀浓缩等操作以外，浮游藻类的显微镜定量方法尤为重要。

目前在对浮游藻类进行镜检时一般采用的是0.1ml计数框(规格：20mm×20mm；计数框横、纵方向划线分为等量的10行×10列)。定量方法主要有三种：①计数框行格法，对计数框上第二、五、八行三行共30个小格进行计数；②目镜视野法，利用显微镜的目镜视野在计数框上均匀选取计数的面积，需先用测微尺量得一定放大倍数下[一般为400倍：40(目镜)×10(物镜)]的视野直径，然后用圆面积计算公式(πr²)求得单个视野面积，一般计数100-500个视野；③目镜行格法，是在目镜上利用两条玻璃丝形成平行的横行(一般宽度100-150μm)，只计数两横行之间出现的藻类，或者利用目微尺上的刻度来限定计数区域，通过连续移动显微镜托物平台来完成计数。方法①工作量大，同一行内往复计数时重复计数的概率较高，现已较少用；方法②可避免重复计数，但选取视野时容易受人为主观倾向影响()，选择视野的随机性不够，而且工作量大；方法③是综合①②两种方法而来，大大降低了工作量和人为主观性，但操作上较为复杂，首先，光学显微镜作为精密仪器，在其目镜上人为添加玻璃丝难度极大，其次，在连续移动托物平台时，判断和保持目镜玻璃丝或是目微尺处于与托物平台移动方向垂直的水平位置，也有较大难度，如若不垂直，则计算计数面积时就会产生误差。

技术实现要素：

本发明提供了一种基于计数框的浮游藻类定量方法(即视野行格法)，该方法包括如下步骤：

将显微镜的视野调至计数框的左或右竖直边框，使左或右竖直边框位于视野的中间，横向缓慢移动显微镜托物台，并计数视野扫过的范围内所有藻类，直到抵达计数框的另一竖直边框；

根据公式N＝20n/XD计算计数框所承载的水样中藻类总数量；

其中：N为0.1ml水样中的藻类数量，X为计数的行数，D为视野的直径，n为X行的总计数；

其中的“行”是行进过程中视野上下边缘形成的两条虚拟边线之间的“行”；所述“行”的长度即为视野从计数框一边行进至另一边的距离，也即计数框的边框长20mm；

其中所述“行”的宽度为视野直径D，每一行的面积为20D；

计数的行数根据藻类的多少来确定，一般为3-5行。

本发明所提供的视野行格法需先测定一定放大倍数下，显微镜的视野直径(以上海光学仪器一厂的普通生物显微镜XSP-2CA型为例，400倍放大倍数下，视野直径D为0.45-0.475mm)；

本发明的基于计数框的浮游藻类定量方法——视野行格法，相比现有的基于计数框的其他定量方法具有以下优势：

(1)工作量小，本发明能将一个样品的计数时间控制在30分钟以内(使用计数框对浮游藻类进行定量时，若计数时间过长，随着计数框内的水样自然蒸发，空气会以气泡的形式渗入到盖玻片与计数框之间，对剩余的水样形成挤压，从而移动水样中的藻类在计数框内的位置，进而造成计数结果不可用，因此必须尽可能的减少计数所花费的时间)；

(2)消除了目镜视野法中视野选择的主观性(采用目镜视野法时，具体操作过程中，人的主观倾向于选择有藻类出现的视野进行计数，导致结果比实际偏高，此法适用于单种藻类的纯培养计数)

(3)操作简单，因为不需要在目镜上作任何操作，也不需要借助目微尺来界定每一行，而是利用行进中的视野自身来界定上下边线，避免了复杂的操作。

附图说明

图1计数框

图2视野行格法运行图

其中：1、计数框边框线；2、计数框行格线；3、视野；4、视野横向运行虚拟边线

具体实施方式

下面结合附图对本发明做一详述，但本发明并不限于此。

本发明所提供的视野行格法是基于计数框的一种浮游藻类定量方法。

实施例1

水样采自江西鄱阳湖(2014年8月)，1L水样经鲁哥式液染色固定后，在玻璃沉降柱中重力沉降48h，上清液用虹吸导管排出，用100mL广口塑料瓶收集沉降柱底部藻类浓缩液，并定容至50mL。

(1)测定400倍放大倍数[40(目镜)×10(物镜)]下显微镜视野3的直径D(本例中使用上海光学仪器一厂的普通生物显微镜XSP-2CA型，400倍放大倍数下，视野直径D为0.45mm)；

(2)上下摇动装有50mL水样的100mL塑料瓶5-10次，移液器吸取其中0.1ml待测水样放置在计数框中，盖上盖玻片，静止数分钟后置于显微镜托物台；

(3)400倍放大倍数下对焦，将视3调至计数框右侧边框线1的中段[计数框行格线2的第五行格]，使边框线位于视野的竖直中线处，横向缓慢移动托物台时开始计数(借助计数器手动计数)，直至抵达计数框的左边框线为止，计数视野扫过的区域[视野行进过程中形成的虚拟边线4与计数框纵向边框线(1)所包围的长方形区域]内所有不同种类的藻类数量；

(4)纵向移动托物台，使视野位于计数框纵向边框线1的下部中段(计数框第八行)，与上一步骤反向横向移动视野，计数整个视野行的藻类数量，合计2个视野行的藻类总数为473个(总计出现23个种类)；

(5)以公式N＝20n/XD来计算所测0.1mL中的藻类总数N(X为计数的行数，D为视野的直径，n为X行的总计数)

N＝20n/XD＝(20×473)/(2×0.45)≈1.05*10⁴

则1L原水样中的藻类总数N′为5.25*10⁶[N′＝(50/0.1)×N，50为1L水浓缩后定容的体积，0.1为加入计数框的浓缩水样的体积]；

同一水样，自第(2)步骤开始至第(5)步骤，重复计数操作的结果为436个(20个种类)，两次重复计数藻类数量与平均值相差4.2％、种类数相差7.5％，结果可信。(两次重复计数的结果与平均值之间的差值应小于15％时，否则需重新取样计数。《淡水浮游生物研究方法》，科学出版社)

实施例2

水样采自上海市奉贤区稻田田面水(2016年6月)，1L水样经鲁哥式液染色固定后，在玻璃沉降柱中重力沉降48h，上清液用虹吸导管排出，100mL广口塑料瓶收集沉降柱底部浓缩液，并定容至30mL。

(1)测定400倍放大倍数下显微镜视野3的直径D为0.45mm；

(2)上下摇动装有30mL水样的100mL塑料瓶5-10次，移液器吸取其中0.1ml待测水样放置在计数框中，盖上盖玻片，静止数分钟后置于显微镜托物台；

(3)400倍放大倍数下对焦，将视野3调至计数框右侧边框线1的中段[计数框行格线2的第六行格]，使边框线位于视野的竖直中线处，横向慢慢移动托物台时开始计数，直至抵达计数框的左边框线为止，计数视野扫过的区域内所有不同藻类的数量；

(4)纵向移动托物台，使视野先后位于计数框纵向边框线1的中上部(计数框第二、四行)和下部(计数框第八行)，横向移动托物台，分别计数4个视野行内的藻类数量，合计4个视野行的藻类总数为152个(总计出现9个种类)；

(5)计算0.1mL藻类浓缩液中的藻类总数

N＝20n/XD＝(20×152)/(4×0.45)≈1.69*10³，

则1L原水样中的藻类总数N′为5.07*10⁵[N′＝(30/0.1)×N，30为1L水样浓缩后定容的体积，0.1为加入计数框的浓缩水样的体积]；

同一水样，自第(2)步骤开始至第(5)步骤，重复计数结果为179个(11个种类)，两次重复计数藻类数量相差8.2％、种类数相差10％，结果可信。