发明背景
发明领域
本发明涉及高效采集按迁移率分离的前体离子的碎片离子质谱的方法,以鉴定复杂物质混合物中尽可能多的物质(尤其是自底向上的蛋白质组学工作流程中的消化多肽),或以准确特性对物质进行定量。
背景技术:
概述
在蛋白质科学领域,对于通过液相色谱/质谱分析(lc-ms)从提取自生物样本的蛋白质的水解消化液中鉴定出尽可能多的多肽和蛋白质,人们的兴趣越来越浓厚。已经证实,迁移谱与质谱联用可改进测量以实现这一目标。作为执行这些测量的仪器的例子,可以采用具有前端物质分离器(如液相色谱仪(lc))和质谱仪(ms)的组合装置,质谱仪配备一个离子积聚器、一个离子迁移分离器、一个质量过滤器(通常是rf四极杆质量过滤器)、一个离子破碎池和一个位于下游的高分辨率正交离子注入飞行时间质量分析器。图1显示了一个此类典型仪器的示例。可使用离子阱来积聚离子迁移分离器上游的离子,并使用漂移管离子迁移谱仪来按迁移率分离离子。
使用这种仪器,可在不过滤质量和破碎离子的情况下利用迁移分离器和飞行时间分析器测得图2中所示的质量-迁移率图。该图通常显示离子质量与漂移管中漂移时间的关系。从此图中选择具有特定迁移率和质量的感兴趣离子种类,如图2中椭圆形所示。在第二个循环中,按离子迁移率再次在时间上分离来自离子积聚器的新离子。调整质量过滤器以便在离子种类的特定漂移时间间隔内选择感兴趣的离子种类,这些离子种类随后在破碎池中破碎,并通过飞行时间质量分析器采集所需碎片离子谱。
在文献us6,960,761b2(“在作为预选离子迁移率和离子质量函数的时间内分离离子的仪器”,d.e.clemmer,2001年)中,这种简单依靠数据的碎片离子采集方法已经得到大幅改进,离子源离子的利用率更高。本文描述了使用大量不同的离子源、离子阱、离子迁移分离器、质量过滤器、碰撞池、离子反应器和高分辨率质量分析器的组合分离混合物中离子的各种方法。此外,所描述的相应装置由离子源、离子阱、离子迁移分离器、质量过滤器、碰撞池、离子反应器和高分辨率质量分析器以不同的顺序组合。离子阱用于积聚离子。中等长度的漂移管离子迁移谱仪用作离子迁移分离器。在装置的变化形式中,可以找到符合图1的装置(请参见clemmer文献中的图9和权利要求21和22)以及图4中所示的操作方法(请参见clemmer文献中的图13和权利要求4和5)。文中介绍了连续测量所选离子种类的方法(请参见clemmer文献第20栏第64行至第21栏第21行)。图3显示了第一个测量循环中人为构建的质量迁移率图。在质量-迁移率图中选择几个感兴趣的离子种类(根据clemmer给出的图,大约为五种)。所选离子种类必须按其不同的迁移率在时间上充分分离。所选各离子种类的时间间隔必须确保可电子切换四极杆质量过滤器的电压以过滤接下来要测量的所选离子种类。在后续测量循环中,新离子在离子阱中积聚,然后按其离子迁移率分离(clemmer未明确概述方法的这部分,仅可从图13间接导出)。如果感兴趣的离子种类未按其离子迁移率在没有任何重叠的情况下清晰分离,则质量过滤器将按漂移时间和质量陆续选择离子种类,这些离子种类在破碎池中破碎,并由飞行时间分析器测量出碎片离子质谱。从clemmer的图14和15中,可以推断在一次测量循环中可获得大约五个碎片离子质谱。在下一个循环中,可测量从相同质量-迁移率图中选择的其他离子种类的碎片离子谱,以此类推。这样,由于lc峰中显示的不同离子种类在时间上彼此分离并由此富集于其相应的迁移率峰中,因此大幅提高了离子源离子的利用率,迁移率峰在时间上短于lc峰,从而在一秒钟内可测量一百多个碎片离子谱,但前提是可在质量迁移率-图中检测到不同离子种类的数量。情况可能并非总是如此。
图4中概述了此多循环程序重要部分的流程图。该图介绍了d.e.clemmer在十几年前发明的方法之一,但为了清楚起见,引入了新术语“测量环路”和“测量循环”。
在文献wo2013/140132a2(“改进依靠数据采集的多维测量扫描”,k.giles和j.l.wildgoose,2013年)中,该方法被概括为按两种不同的离子特征分离,例如按质量和迁移率。
现在,市面上有两种对应于图1中所示类型的商用仪器。agilent6560离子迁移率四极杆飞行时间lc/ms系统的特征是,用于离子积聚的俘获漏斗和用于迁移率扫描的八十厘米漂移管(rmob≈60),可在大约五十毫秒的漂移持续时间内进行整个迁移率范围的扫描。watersvionimsqtof质谱仪使用行波离子迁移谱仪(rmob≈30)按其离子迁移率分离离子。在这两种仪器中,延长扫描持续时间(例如通过降低漂移场电压)可降低离子迁移率分辨率。使用最高离子迁移率扫描速度,即最低离子迁移率扫描持续时间,将达到最大离子迁移率分辨率,但在实际操作中存在限制。实际上,几乎不可能根据分析任务的需求来调整分离特性。
俘获离子迁移谱仪(“tims”)是与恒定电场漂移管(简称:漂移管)和行波迁移谱仪完全不同的离子迁移谱仪。使用气流中的电场势垒来按离子迁移率阻止离子;场势垒降低将释放离子,离子迁移率增加,从而产生离子迁移谱。tims的非凡独特特征是,在增加扫描持续时间时,离子迁移率分辨率持续增高。文献us7,838,826b1(m.a.park,2008年)中详细介绍了tims。
特别地,为了达到在质量-迁移率图中找到和鉴定尽可能多的离子种类的目的,需要改进从提取自生物样本的蛋白质的蛋白质水解消化液中采集大量碎片离子质谱的方法。若想让质谱仪离子源中产生的离子种类的可检测性最高,就需要收集尽可能多的离子。但收集更多离子不应降低每单位时间可测量的碎片离子质谱的数量。此外,还需要改进对提取自生物样本的蛋白质的蛋白质水解消化液中物质进行定量的方法。
技术实现要素:
本发明提供了一种通过含离子源、离子迁移分离器、质量过滤器、离子破碎池和质量分析器的质谱仪来采集复杂物质混合物中物质的碎片离子谱的多循环方法。在第一个测量循环中,测得离子迁移率扫描时间相对于离子质量的图,从该图中可选择几组具有不同质量和不同迁移率扫描时间且在时间上分离的离子种类。在接下来的测量循环中,按迁移率扫描时间选择每组离子种类,在质量过滤器中按质量过滤,并在破碎池中破碎,然后通过质量分析器测得碎片离子质谱。该方法的特征是,俘获离子迁移谱仪(tims)用作离子迁移分离器。
tims取代d.e.clemmer使用的漂移管离子迁移分离器。照例,该质谱仪可选择配备前端物质分离器,例如液相色谱仪或毛细管电泳单元。图5中显示了此类仪器。引入和使用tims来取代传统迁移谱仪不仅仅是简单的取代:不同工作模式可提供几种独特优势,只有深入研究tims的特性才能明白其中某些优势。
tims在20毫秒的扫描持续时间可达到60的迁移率分辨率。完整采集碎片离子质谱平均需要大约2.5毫秒,其中包括将质量过滤器切换至下一质量、过滤所选离子种类、破碎此离子种类的离子和通过质量分析器(通常是飞行时间质量分析器)测量碎片离子质谱。一般来说,离子迁移率峰的宽度总计约一到二毫秒。在20毫秒的离子迁移率扫描持续时间内,可测得一组八个所选离子种类的碎片离子质谱。考虑到测量循环之间的一段离子传输时间,在仅20毫秒内就可每秒采集一组八个离子种类含300个以上碎片离子质谱。
在第一个实施方案中,tims以并行积聚模式运行,其中,在测量循环期间,离子源的离子被提供给离子迁移分离器,且并行于测量循环进行积聚。可调整离子积聚持续时间以便获得图上预先确定的可检测离子种类数。优选地,tims的离子迁移率扫描持续时间大体上等于离子积聚持续时间。美国专利申请14/614,456(“可并行积聚的俘获离子迁移谱仪”,m.a.park和m.schubert)中介绍了并行离子积聚tims。
并行积聚tims可提供延长离子积聚持续时间以便在不降低碎片离子质谱测量能力的情况下找到更多可检测离子种类的独特可能。优选地,在积聚单元的电场势垒上升沿收集离子,从而使离子沿上升沿按离子迁移率在空间上分离。因此,积聚的离子受空间电荷的影响比漂移管或行波离子迁移分离器中所用积聚器中的离子所受的影响更小。但最重要的是,tims的独特之处,即更长的积聚时间期限允许通过选择相应延长的迁移率扫描持续时间提高迁移率分辨率,例如,扫描持续时间为100毫秒时,离子迁移率分辨率rmob=90。由于所收集离子数量更多且离子迁移率分辨率更好,因此可以在质量-迁移率图中检测到更多的离子种类。碎片离子谱的采集率基本保持恒定,因为分离的迁移率峰的时间宽度仍与采集碎片离子谱所需的典型时间在同一个数量级上(2.5毫秒或更少)。
在第二个实施方案中,tims以进一步使用空间或时间缩放的并行积聚模式运行。在空间缩放模式,离子仍积聚在积聚单元的电场势垒上升沿上。但用于空间缩放的电场势垒上升沿更加平缓,并且在上升沿的末端包含一个场峰值,该峰值在离子积聚期间阻止低迁移率的离子种类。所选迁移率范围的离子种类积聚在场梯度比场峰值小很多的上升沿部分。与其他离子种类相比,所选离子种类在空间上解压,以降低空间电荷效应,从而可使用更长的积聚持续时间无干扰地收集更多所选离子迁移率范围内的离子种类。空间缩放的电场势垒可进一步包含一个位于电场势垒开头的陡峭电场梯度。然后可在限定迁移率范围内测得所选离子种类的迁移率-质量图。空间缩放可在更长的积聚时间期限内无干扰地检测和收集更高数量的所选离子迁移率范围内的离子。同时,离子迁移率分辨率更高,因为扫描更小的迁移率范围。本方法使离子可检测,而这些离子在具有离子迁移分离器的任何其他商业质谱仪的任何操作模式均不可见。可根据物质混合物中生成的离子种类的离子迁移率分布调整空间缩放的所选离子迁移率范围。
lc-ms仪器在20毫秒积聚持续时间内测得的质量-迁移率图中通常不能提供300个不同的可检测离子种类。在这一工作模式,无法完全发掘此仪器每秒测量300个以上碎片离子质谱的能力。
依靠数据的现有技术方法存在的主要问题之一是质量-迁移率图中离子种类的可检测性。如果在质量-迁移率图中无法检测到某一离子种类,则在依靠数据的碎片离子谱采集中就无法获得该碎片离子谱。更高的可检测性需要积聚更多数量的离子。对于优化的离子源而言,仅可通过延长积聚持续时间来获得更多数量的离子。对于漂移管或行波离子迁移分离器而言,延长在前端离子阱或类似装置中的积聚持续时间可成比例降低碎片离子谱的采集率,因为在离子阱内的延长积聚时间内,仅可执行一个测量碎片离子质谱的测量循环。此外,由于在没有严重空间电荷效应的情况下,仅有有限数量的离子可以插入到漂移管中,因此积聚时间不能延长得过多。
符合本发明的方法可进一步包括额外质量-迁移率图的测量。优选地,在预先确定的时间间隔结束时,在已采集预先确定数量的碎片离子谱时,或者现有质量-迁移率图基本不再提供足够可选择的未测量离子种类时,测量新的质量-迁移率图。新的质量-迁移率图的离子积聚持续时间可不同于之前的质量-迁移率图的离子积聚持续时间,例如,离子积聚持续时间可以增加以便在后续的质量-迁移率图中获得更多可检测离子种类。此外,测得的质量-迁移率图的迁移率范围可能彼此不同。在后续测量的质量-迁移率图中可调整所选迁移率范围以涵盖样本中的所有感兴趣离子种类。
符合本发明的方法可进一步包括在后续测量循环中重复测量相同离子种类的碎片离子质谱以提高其质量。当获得预先确定的质量后,或使用碎片离子谱在数据库搜索中确认了离子种类,则结束相同离子种类的碎片离子质谱的重复测量。
复杂物质混合物通常是提取自生物样本的蛋白质的蛋白质水解消化液。消化多肽优选地通过前端液相色谱仪或电泳单元分离。消化多肽离子的碎片离子谱用于通过在自底向上的蛋白质组学工作流程中公知的数据库搜索鉴定相应的蛋白质。
符合本发明的其他方法涉及准确对混合物中的物质进行定量。以短离子迁移率扫描持续时间和每秒钟大量的测量循环进行重复测量尤其适用于以高精度对所选蛋白质或多肽进行准确定量。例如,特别是,可在覆盖完整lc峰的每个测量循环中测量在碰撞池中分离为“报告离子”的标记多肽离子以改进定量。这种方法不需要高可检测性就可获得大量的离子种类,选择少量前体离子就可满足分析需求。
质量分析器优选为正交离子注入飞行时间分析器(otof)。otof质量分析器提供高质谱采集率以及高质量分辨率。采集率介于1khz和20khz之间,通常约为10khz。可达到超过10000,最高可达100000或更高,通常约为30000至50000的高质量分辨率,特别在通过电喷雾源产生的消化多肽离子的质量范围内更是如此。
质量过滤器优选为rf四极杆质量过滤器。rf四极杆质量过滤器可切换至接下来要测量的离子种类的质量,方法为先关闭穿过质量过滤器的传输,然后切换至下一个质量,然后在要测量的下一个离子种类的正确时间再次打开。rf四极杆质量过滤器优选切换至接下来要测量的离子种类的质量,保证下一个质量低于之前的离子种类的质量。在rf四极杆质量过滤器的切换时间内,可中断或加速离子迁移率扫描。
破碎池优选为不会俘获离子的流通池。离子优选在填充气体的池中通过碰撞诱导解离进行破碎,但是也可通过电子轰击或光子诱导解离(通过使用红外或紫外线光源)进行破碎。
本发明方法的第三个实施方案不一定基于tims离子迁移分离器。本方法提供了一种通过含离子源、离子迁移分离器、质量过滤器、离子破碎池和质量分析器的质谱仪来采集复杂物质混合物中物质的碎片离子谱的多循环方法。在第一个测量循环中,测得离子迁移率扫描时间相对于离子质量的图,从该图中可选择几组具有不同质量和不同迁移率扫描时间且在时间上分离的离子种类。在接下来的测量循环中,按迁移率扫描时间选择每组离子种类,并在质量过滤器中按质量过滤,然后在破碎池中破碎。通过质量分析器测得碎片离子质谱。本方法的特征是,在不同测量循环中测得至少一个离子种类的两个以上碎片离子谱,以改进碎片离子谱或其总质谱的质量,或来检验后续获得的碎片离子谱。
对于此第三个实施方案,离子迁移分离器可以是俘获离子迁移谱仪、漂移管离子迁移谱仪和行波离子迁移谱仪之一。质量分析器优选为正交离子注入飞行时间分析器(otof)。otof质量分析器提供高质谱采集率以及高质量分辨率。质量过滤器优选为rf四极杆质量过滤器。破碎池优选为不会俘获离子的流通池。离子优选在填充气体的池中通过碰撞诱导解离进行破碎,但是也可通过电子轰击或光子诱导解离(通过使用红外或紫外线光源)进行破碎。
在此第三个实施方案中,在采集所测得图中可检测的每个离子种类或图中所选列的每个离子种类的碎片离子谱之后,可以开始至少一个离子种类的第二个和更多碎片离子谱的测量。
在此第三个实施方案中,一个离子种类碎片离子谱的重复测量可在已采集该离子种类预先确定的碎片离子谱数量后,在获得碎片离子谱或其总质谱预先确定的质量后,在完全扫描色谱峰后,或使用碎片离子谱在数据库搜索中找到该离子种类后结束。
在所有这些实施方案中,在预先确定的时间间隔结束时,在已采集预先确定的碎片离子谱数量时,或现有质量-迁移率图基本不再提供足够未测量或未鉴定的离子种类时,可测量额外的质量-迁移率图。可汇总额外质量-迁移率图以提高所有图中可检测离子种类的数量。
附图简要说明
图1显示了符合现有技术的lc-ims-ms-ms质谱仪的原理概述图。在上文引用的文献us6,960,761b2(d.e.clemmer,2001年)中,将离子阱用作离子积聚器,还有一个漂移管离子迁移分离器。
图2显示了使用图1中所示仪器,在选择一个离子种类的情况下,在大约30毫秒持续时间内的第一个测量循环中测得的现有技术质量-迁移率图。在此图中,仅使用了离子迁移分离器和飞行时间分析器,没有通过质量过滤器过滤质量,并且没有在破碎池中破碎离子。该图照常显示离子质量与漂移管中漂移时间的关系。选择一个离子种类以便在后续的测量循环中进行进一步测量。
图3显示了根据d.e.clemmer的发明在选择五个感兴趣离子种类(用椭圆表示)的情况下测得的现有技术质量-迁移率图。此后,可在一个测量循环中测得五个所选离子种类的五个碎片离子质谱。离子种类的选择方式为,在所选不同离子种类的漂移时间之间切换质量过滤器的电压。
图4显示了测量多个碎片离子质谱的多循环方法的基本步骤流程图。该图引入了术语“环路”和“循环”。(1)在测量来自积聚器的新离子的第一次测量中,开始新的环路,测得一个质量-迁移率图。(2)从该图选择感兴趣的离子种类。在现有技术方法中,如图3所示选择大约五个离子种类。(3)在持续时间与图测量相同的测量循环中,来自积聚器的新离子再次按其迁移率在时间上分离,但在这一步骤由质量过滤器陆续选择感兴趣的离子,这些离子在破碎池中破碎,并通过飞行时间质量分析器采集碎片离子质谱。(4)如果不需要新的质量-迁移率图,可在相同质量-迁移率图中选择更多离子种类,并可在新测量循环中获得相应的碎片离子质谱。否则,可测得新的质量-迁移率图,开始新环路。根据物质分离装置的时间特性,可在0.5至3秒的时间间隔内重复新质量-迁移率图的测量环路。在这种类型的现有方法中,每秒可执行大约30个中间测量循环,从而能够达到每秒大约测量150个碎片离子谱的能力。
图5举例说明用于符合本发明之方法的质谱仪,通过并行离子积聚俘获离子迁移分离器(tims)取代离子积聚器和离子迁移分离器的传统组合。这种取代的做法可在某种程度上带来令人惊讶的优势,主要与多肽离子的可检测性和鉴定有关。
在图6中,tims仪器的离子迁移率分辨率被绘制为扫描整个离子迁移率范围所需的持续时间的函数。扫描持续时间仅20毫秒时,离子迁移率ko=0.5m时,可实现大约rmob=60的迁移率分辨率,而在300毫秒的扫描持续时间时,分辨率可升高至rmob=120。
图7图示说明专利申请us14/614,456(“可并行积聚的俘获离子迁移谱仪”,m.a.park和m.schubert)中介绍的迁移谱仪的实施例。离子通过入口被引入毛细管(8),被气体(7)携带至质谱仪的第一个真空段。携带的离子(6)被推斥板(9)推送通过rf离子漏斗(10)进入俘获离子迁移谱仪(11a,11b)。俘获离子迁移谱仪包括细长通道(11),该通道分为离子积聚单元(11a)和离子迁移率扫描单元(11b)。气流(14)推动离子通过细长通道(11)。该谱仪还包含在通道电极象限处提供rf电压的rf电压源单元(未显示)以及在两个通道单元轴向上产生电场势垒的dc电压源单元(同样未显示),与电极在位置(33)和(37)处接触。通道(11)内的四极rf场将离子固定在装置的轴附近。两个通道单元中隔膜之间的电阻链产生用于离子积聚单元(11a)和离子迁移率扫描单元(11b)的两个直流电场势垒,如图下部图(a)中所示。气流(14)将离子推向电场势垒,从而按离子迁移率将离子分离。在离子迁移率扫描期间,施加到扫描单元(11b)电极(37)的电压稳定降低,因而释放迁移率增高的离子种类,从而产生离子迁移谱。
图8显示了优选用于本发明的空间缩放工作模式,显示了没有空间缩放的正常工作电场势垒(a)和有缩放工作的势垒(b)。空间缩放基于场势垒(b),该场势垒在z轴位置(41)和(42)之间有宽且平缓的电场梯度,在(42)和(43)之间具有陡峭的场梯度场峰值,从而在离子积聚期间阻止低迁移率的离子。在非缩放势垒(a)的位置(31)和(32)之间,感兴趣离子迁移率范围的离子积聚在(41)和(42)之间场势垒的平缓部分上。离子在空间上解压,以降低空间电荷效应,从而可使用更长的积聚持续时间无干扰地收集更多离子。离子迁移率扫描单元(11b)显示了相似电场分布,但没有场峰值。按离子迁移率扫描(45)和(46)之间储存的离子后,积聚单元的离子将在大约一毫秒的时间内传输至离子迁移率扫描单元(11b),因而让位置(42)和(43)之间峰值斜坡上储存的不感兴趣的低迁移率离子通过。位置(45)和(46)之间储存的离子种类可比平常扫描得更慢,从而可产生高离子迁移率分辨率。
图9在上部(c)显示了人为构建的质量-迁移率图,该图显示了整个迁移率范围,在下部(d)显示另一个质量-迁移率图,该图通过应用空间缩放使较高的离子迁移率分辨率被限制于大约1/3。可使用图5中质谱仪的tims迁移分离器和飞行时间分析器测量此类图,该质谱仪配备电压发生器以产生空间缩放所需的额外电压。上部(c)中,可以证明在持续20毫秒的每个测量运行中可测量大约八个所选离子种类(在图中,选择了七个离子种类),从而能够在每秒钟测量超过300个碎片离子质谱。下部质量-迁移率图(d)的离子迁移率范围仅代表完整迁移率范围的1/3,这通过在平坦离子积聚或离子迁移率扫描区域末端正确施加所选电压实现。通过延长到三倍,即60毫秒的积聚时间,可收集多达三倍的离子,通过将扫描速度降低至九倍(对应于总迁移率范围的180毫秒),可实现rmob≥100的迁移率分辨率,二者均提高了可检测性。在相应质量-迁移率图中可检测更多的离子种类;这种改进具体取决于物质混合物。在一次测量循环内,可选择大约24个离子种类;在图中,仅标记了14个离子种类。在一秒内可采集多达350个的离子碎片质谱,获得大量有用碎片质谱的可能性大幅提高。同样地,可使用测量循环来重复测量相同离子种类以改进谱质量。
详细说明
本文使用的表述“分离器”和“分离”是用于在时间上分离不同物质或不同离子种类的装置和方法。色谱分析、毛细管电泳和离子迁移谱分析是分离方法。术语“过滤器”适用于仅让所提供的多种离子中的所选离子种类通过的装置和方法。例如,能够按质量过滤离子的rf四极杆质量过滤器。
“碎片离子质谱测量循环”,简称“循环”或“测量循环”,开始于从积聚单元传输新离子至离子迁移率扫描单元,并测量从质量-迁移率图中选择的离子种类的一组碎片离子质谱。本文使用的术语“测量环路”有特殊含义,开始于新质量-迁移率图的测量,随后是几个碎片离子质谱测量循环。
“迁移率扫描时间”或“迁移率扫描持续时间”定义为在感兴趣的离子迁移率范围内离子迁移率扫描的持续时间,通常是储存的离子的迁移率范围。
本发明提供采集样本中物质的碎片离子谱的方法。在第一个测量循环中,物质的离子由离子迁移分离器在时间上分离,然后在不破碎的情况下由质量分析器中进行分析,以提供离子种类的离子迁移率扫描时间相对于离子质量的图。从图中选择多组离子种类,每组包含根据离子迁移率扫描时间彼此分离的离子种类。在每个后续测量循环中,物质的离子种类由离子迁移分离器在时间上分离,并在所选离子种类的离子迁移率扫描时间内,将质量过滤器在时间上调整为其中一组离子种类的质量,破碎过滤的离子种类并在质量分析器中采集碎片离子谱。本发明的特征为离子由俘获离子迁移谱仪(tims)分离。
在预先确定的时间间隔结束时,在已采集预先确定数量的碎片离子谱时,或采集第一个图中的几乎全部离子种类的碎片离子谱时,可测量第二个质量-迁移率图并从第二个图中选择第二组离子种类。可在测量第一个和第二个图之前积聚离子。例如,第二个图的积聚持续时间可比第一个图增加,则第二组基本包含未在第一个图中选择的离子种类。第一个和第二个图的离子迁移率范围以及第一个和第二个图测量之后的测量循环的离子迁移率扫描时间可以不同。此外,在后续测量循环中可测量至少一个离子种类的碎片离子谱并汇总在一起,以改进质量。
如图1中所示,带前端物质分离器和离子迁移分离器的质谱仪主要用于通过其碎片离子质谱鉴定大量多肽和蛋白质。本发明提出了使用俘获离子迁移谱仪(“tims”),从而形成图5中所示的质谱仪。引入和使用tims来取代漂移管迁移谱仪不仅仅是用更短的仪器来简单取代较长仪器;这些实施方案可提供几种优势,只有深入了解tims的特性才能明白其中某些优势。除了仅引入tims取代现有技术迁移分离器的实施方案外,优选实施方案使用并行离子积聚tims。
本发明主要基于俘获离子迁移谱仪“tims”,例如文献us7,838,826b1(m.a.park,2008年)中介绍的俘获离子迁移谱仪,该迁移谱仪优选额外配备额外前端积聚单元,该积聚单元能够积聚在迁移谱仪的扫描阶段产生的离子,并能在大约一毫秒的短时间内将储存的离子传输至离子迁移谱仪。因此,特别优选的实施方案包括可提供额外dc电压以产生空间缩放的dc发生器。
值得注意的是,tims是能够在延长的离子迁移率扫描持续时间内提高离子迁移率分辨率的唯一离子迁移谱仪类型。
由离子阱等任何前端离子收集单元收集并传输至离子迁移分离器的离子数量被积聚离子之间的排斥库仑力作用(简称“空间电荷效应”)大幅限制。为了克服空间电荷问题,本发明的优选实施方案使用并行积聚tims装置,由于离子已经积聚,按其离子迁移率分离,并且受空间电荷的影响更小,因此可比常见的离子积聚器收集更多的离子。只要积聚时间期限不是特别长,本装置就可使用离子源提供的几乎所有离子进行测量,即,这些模式具有最高的灵敏度和最高离子利用率。
通过图5中所示仪器的实验证明,测量碎片离子质谱所需的时间,即将四极杆过滤器切换至新质量、让所选离子种类通过、破碎该种类的离子和通过飞行时间分析器采集碎片离子质谱的时间,总计仅大约2.5毫秒。此外,离子从积聚器传输至离子迁移率扫描单元并在其新位置的气流内抑制离子运动所需的时间大约是1.5毫秒。以20毫秒离子迁移率扫描持续时间和1.5毫秒传输时间(即每个循环21.5毫秒)运行的测量程序,每秒内可产生一个质量-迁移率图和大约45个测量循环,每个测量循环可测量八个碎片离子质谱。因此测量能力共计每秒45×8=360个碎片离子谱,其性能远远超过任何现有技术的迁移分离器。
基本工作模式下,这一每秒可采集360个碎片离子质谱只是近似值,很大程度上取决于每次测量碎片离子质谱所需的时间。如果这一时间(假设为2.5毫秒)可缩短至2.0毫秒,则能力将增加至每秒大约450个碎片离子谱。实际能力可能为每秒300到450个碎片离子谱。在实验中,达到了每秒380个碎片离子质谱。
碎片离子质谱通常由飞行时间分析器的大约25个单次谱采集汇总而成,如果每秒钟处理10000个样本,就可改进质谱的质量。
如上所述,使用tims的基本测量程序,每秒可测量300个以上的碎片离子谱。tims具有相对较高的离子迁移率分辨率,在仅20毫秒的短离子迁移率分离时间内,就可达到大约rmob=60的分辨率。与现有技术比较,基本工作模式就可实现大幅改善,每秒钟可采集更多的碎片离子谱,并且离子迁移率分辨率更高。例如,图9在上部(c)中显示了人为创建的质量-迁移率图,该图在每个循环选择七个离子种类的情况下,显示了一个样本中离子种类的完整迁移率范围。此类图可使用tims作为迁移分离器和图5中质谱仪的飞行时间分析器测量。在此上部(c)中,可以看出,在21.5毫秒持续时间的每个测量循环中可测量最多八个所选离子种类,从而能够在每秒钟测量300个以上的碎片离子质谱。
短离子迁移率扫描持续时间和每秒钟大量测量循环的这一模式尤其适用于以高精度对复杂混合物中所选蛋白质或多肽进行准确定量。众所周知,存在通过可分解连接肽将感兴趣的标记多肽与同量异位质量标记结合使用的定量方法。特别是,可在覆盖完整lc峰的每个测量循环中测量在碰撞池中分离为“报告离子”的标记多肽离子以改进定量的准确度。这种方法不需要高可检测性就可获得大量的离子种类,选择少量标记的前体离子就可满足分析需求。这种基于ims-ms-ms的定量方法尤其适用于以高准确度测量物质的相对丰度。
另一方面,可将分析目标定为鉴定尽可能多的物质。虽然在仅20毫秒的积聚持续时间测得的图中可检测到几百个离子种类,但即使高性能离子源通常也不能提供几百个离子种类。因此,在这种情况下,无法完全发掘每秒测量300个以上碎片离子质谱的能力。
质量-迁移率图中离子种类的可检测性是此多循环方法的主要问题之一。如果无法检测到离子种类,就无法用依靠数据的方法获得该离子种类的碎片离子谱。更高的可检测性需要积聚更多数量的离子。对于优化的离子源而言,仅可通过延长积聚持续时间来获得更多数量的离子。
对于现有技术的方法,延长积聚持续时间将大幅降低每单位时间碎片离子质谱采集循环的数量,因为延长时间不能用于增加测量循环的数量。
可并行积聚离子的tims提供使用更长积聚持续时间的独特可能,优势为相应减慢的离子迁移率扫描将提高离子迁移率分辨率。通过延长积聚和离子迁移率扫描持续时间,积聚离子的数量增加且离子迁移率分辨率将提高,由于锐化离子迁移率峰可增加信噪比,因而可提高可检测性。同时,灵敏度提高,并且在质量-迁移率图中可检测更多离子种类。如果积聚持续时间增加到100毫秒,并且每秒测量一个质量-迁移率图,则在一秒内可执行九次测量循环,每次循环可采集大约40个碎片离子质谱,使质量-迁移率图中的离子提高五倍。有趣的是,如果再次将碎片离子质谱采集时间假设为精确的2.5毫秒,则测量能力为每秒大约9×40=360个碎片离子谱,几乎保持不变。每个循环多五倍的离子大幅增加了质量-迁移率图中可检测离子种类的数量;这种改进具体取决于物质混合物。然而,假设可检测离子种类的数量增加至少两倍是合理的。
图7中详细介绍了并行积聚tims,它通过图(a)中显示的电场势垒操作。可在专利申请us14/614,456(“可并行积聚的俘获离子迁移谱仪”,m.a.park和m.schubert)中找到此类型系统的详细说明。离子通过入口被引入毛细管(8),被气体(7)携带至质谱仪的第一个真空段。携带的离子(6)被推斥板(9)推送通过rf离子漏斗(10)进入离子迁移谱仪(11a+11b)。气流(14)推动离子通过迁移谱仪(11a+11b)。该谱仪包含分为离子积聚单元(11a)和离子迁移率扫描单元(11b)的细长通道(11a+11b),以及在通道电极象限处提供rf电压的rf电压源单元(未显示)和在两个通道单元内轴向上产生电场分布的dc电压源单元(同样未显示),与电极在位置(33)和(37)处接触。通道内的四极rf场将离子固定在装置的轴附近。两个通道单元中隔膜之间的电阻链产生用于离子积聚单元(11a)和离子迁移率扫描单元(11b)的两个场势垒,如下图(a)中所示。气流(14)将离子推向电场势垒,从而按离子迁移率将离子分离。在未进行空间缩放的情况下,这些电场势垒可正常工作。与普通离子积聚装置相比,可延长此积聚时间,而不会产生空间电荷损失。但是,如果采用的积聚(和扫描)时间过长,那么即使在此装置中,积聚在电场斜坡的离子也可能变得过于拥挤。
因此,即使在本文中,积聚和扫描持续时间的延长也受到限制。当进一步的离子积聚再次受到空间电荷效应影响时,即达到最长的可用积聚持续时间。
如果离子的积聚受空间电荷影响,则“空间缩放模式”可进一步提供改进的工作模式。如果积聚器中离子过于拥挤,则应使用空间缩放模式。空间缩放是特别有利的工作模式,基于图8中(b)中所示场势垒,该场势垒在z轴位置(41)和(42)之间具有宽且平缓的电场梯度,在(42)和(43)之间具有陡峭的场梯度场峰值,从而在离子积聚期间阻止低迁移率的离子。例如,在非缩放分布(a)的位置(31)和(32)之间,感兴趣离子迁移率范围的离子积聚在(41)和(42)之间场势垒的平缓部分上。离子在空间上解压,以降低空间电荷效应,从而可使用更长的积聚时间收集更多离子。离子迁移率扫描单元(11b)显示了相似电场势垒,但没有场峰值。按离子迁移率扫描(45)和(46)之间储存的离子后,积聚单元的离子将通过关闭位置(41-43)的电压在大约一毫秒的时间内传输至离子迁移率扫描单元,因而让场峰值斜坡上储存的不感兴趣的低迁移率离子通过。然后可用非常慢的扫描速度和相应较高的离子迁移率分辨率扫描位置(45)和(46)之间收集的离子。
作为应用空间缩放模式的示例,图9下部质量-迁移率图(d)的离子迁移率范围仅代表完整迁移率范围的1/3,这通过在平坦离子积聚或离子迁移率扫描区域末端正确施加所选电压实现。通过延长大约三倍,即60毫秒的积聚时间,可收集多达三倍的离子,通过将扫描速度降低九倍(对应于总迁移率范围内180毫秒的完整扫描持续时间),可实现rmob≥100的迁移率分辨率。一次测量循环可选择大幅增加的离子种类。因此通过这一程序,可在一次测量循环中检测、选择和鉴定更多离子种类。300个以上离子碎片质谱的能力并未提高,但是由于可检测性大幅增加,因此可测量更多前体离子的碎片离子质谱,在使用现有技术的测量装置和模式中,甚至在其他tims工作模式中均无法检测这些前体离子。
可更改一个环路到下一个环路的空间缩放模式的离子迁移率范围。后续环路可循环使用不同的离子迁移率范围。测量环路之间的时间可介于半秒至几秒之间,这取决于前端物质分离器提供的物质混合物成分改变的速度。在lc运行期间,物质混合物的成分持续改变,平均分子量不断变化,从低质量物质变为更高质量的物质。因此,平均离子迁移率也随lc运行而变化。可通过为空间缩放模式选择离子迁移率范围来考虑这种变化。
可使用还未使用的测量能力部分来反复测量低丰度离子种类的碎片离子质谱,通过将这些谱汇总来改进其质量。可通过丰度计算或通过所产生碎片谱的质量提高来确定后续测量循环中谱采集的重复次数。例如,多肽碎片离子谱的质量可通过谱中的质量差数值(精确对应于氨基酸的质量)来确定,或通过从总碎片离子质谱进行蛋白质鉴定的质量确定。重复采集甚至可以在采集新质量-迁移率图之后在新环路中继续;可在质谱仪计算机内制定和更新要重复测量的离子种类列表。此外,还可制定排除列表,以排除成功鉴定的离子种类,从而避免重复测量这些离子种类;尤其在物质分离单元(例如液相色谱仪)与质谱仪联用时更是如此。
使用空间缩放的工作方法示例可以包括下列步骤。首先,必须选择用于测量碎片离子质谱的离子迁移率范围,并且必须测量相应质量-迁移率图以进行新测量环路。图9中的下部d显示了缩放后的质量-迁移率图,(在本例中)缩放了大约1/3的完整迁移率范围,并在大约60毫秒内收集离子和扫描迁移率。通过这种空间缩放,在2.5毫秒的碎片离子质谱采集时间内,最高可从该质量-迁移率图中选择24种感兴趣的离子。(在图9中,仅选择了14个离子种类)。离子必须按其不同的迁移率在时间上充分分离才能实现高质量的质量分离器切换。必须选择所选离子之间的时间,确保可将rf四极杆离子质量过滤器用电子方式切换到下一个要选择的质量。专为此用途开发的用于优良四极杆质量过滤器的高质量电源需要大约600纳秒的切换时间,还需要留出1.9毫秒的质量过滤时间。有利地,质量过滤器的电压切换能够以这种方式执行:首先关闭(通过稍微增加dc电压)过滤器,然后改变电压,然后针对所选离子种类重新打开过滤器。在针对此离子种类的质量过滤结束时,再次关闭过滤器,并将其切换至下一个离子种类。这样,质量过滤器不仅可以过滤具体离子种类的质量,还能正确选择用于此离子种类的恰当时间间隔。