基于近红外光谱分析技术的青霉素发酵生产过程多模型监控系统的制作方法

本发明涉及液态发酵近红外光谱在线检测的技术领域，特别是涉及一种针对青霉素发酵过程、以近红外光谱仪在线采集发酵液光谱并以多个测量子模型进行过程监测的系统。

二、

背景技术：

青霉素是一种β-内酰胺类抗生素，是青霉菌生长过程中的代谢产物，青霉素能够抑制转肽酶，阻止细菌细胞壁合成中的黏肽交联，使细菌细胞壁合成发生障碍，从而抑制细菌的生长。青霉素从19世纪40年代开始被用于临床，拯救了上亿人的生命。1997年，世界范围内青霉素总产量达到38000吨。青霉素不仅仅可以用于口服和注射，也可以作为制备6-氨基青霉素烷等高附加值抗生素的原料。与青霉素相关的研发和生产具有极其重要的意义。到1999年为止，我国的青霉素产量已占世界40％。但由于我国的青霉素生产起步较晚，我国青霉素发酵的生产工艺和生产效率与国际先进水平仍有着较大的差距。如何提高发酵产量和降低生产成本成为国内发酵研究人员面临的共同课题。

青霉素的发酵过程是一种典型的有氧生化反应过程。在发酵过程中，青霉菌在合适的培养基、pH值、温度、空气流量、搅拌等条件下进行生长和抗菌素合成。青霉素发酵过程不仅仅具有一般非线性系统的时变性、大惯性、强耦合、不确定性等特点，而且发酵过程中的一些重要参数如生物质浓度和产物浓度无法在线测量，导致青霉素发酵过程的自动控制比一般的非线性系统更为复杂和困难，先进的控制工艺难以实施，发挥不出菌种的最大潜力，降低了青霉素的生产效率。实现发酵参数的实时监控对提高我国青霉素发酵工艺水平起着重要的作用。

青霉素发酵过程中，重要的理化参数指标一般包括温度、压力、pH、溶解氧含量、发酵液含糖量、含氮量、细胞浓度、青霉素产物浓度等。对于温度、压力、pH、溶解氧含量等信号，现有的传感器可以实现精密快速的在线检测。但对于发酵液含糖量、含氮量、细胞浓度、青霉素产物浓度等直观反映发酵过程的重要参数指标，目前的技术难以进行实时在线检测。虽然现在各大公司已经研发出折射仪、浊度计等光学仪器，但由于在发酵环境中，发酵液物质成分复杂，上述仪器难以进行有效的检测，精确度无法得到保证。

另一方面，青霉素发酵过程采用分批补料方式。在发酵过程中，当发酵液中基质浓度降低到一定程度时，需要对发酵液进行多次的补料，增加发酵液中的碳源、氮源，以促进青霉菌的营养生长。当发酵过程进入后期产物合成阶段时，又需要对发酵液添加前体。整个发酵过程较为复杂，单一的动力学模型难以进行准确的描述，因而可以将青霉素发酵过程分为多个子模型，每个子模型对应于不同的发酵阶段。针对不同的子模型需要进行采用相应的检测方式。而补料和添加前体的时机选择也依赖于对于整个发酵过程的监控和把握。

针对以上的特点和难点，本发明采用了近红外光谱分析技术作为检测手段，提出了一种全新的多模型监控方法。近红外光谱分析技术具有快速准确、操作简单、无浪费、无污染、一次测试可以测定多种成分和指标等优点。近红外光谱分析技术结合化学计量学方法可以对复杂有机物的组成成分进行精确快速的检测，具有极大的应用潜力。多模型方法可以对青霉素分批补料发酵过程进行更为精确的描述。两者结合，可以使得青霉素发酵过程的监控更为全面和准确，对于先进控制工艺的实施，具有重要的意义。

三、

技术实现要素：

本发明的目的是研发一种快速、准确监测青霉素发酵过程的系统，提供了基于近红外光谱分析技术的多模型分析方法，实现对青霉素发酵过程中的发酵液生物量、含糖量、含氮量以及青霉素浓度等理化指标进行实时在线检测，得到精确的数值和变化趋势。

按照本发明提供的技术方案，本系统包括针对发酵过程的系统硬件设计和软件算法设计和编写两个部分。硬件系统包括光谱采集系统，PLC控制器，工业控制计算机，测量狭缝冲洗装置；软件部分包含PLC程序控制算法，上位机内部光谱采集、存储程序，用以实现发酵工况判别的聚类分析算法、以及多模型切换算法，用于生化指标检测的回归分析算法，以及监控数据和趋势显示程序等。

所述的光谱采集系统采用工业型快速傅里叶变换近红外光谱仪，保证在复杂工况下运行的稳定性，所选光谱仪的波长范围应为700-2500nm，确保覆盖短波近红外和中长波近红外光谱区，光谱的分辨率最少应为16cm-1，以保证光谱的测量精度。光谱仪配备有光纤探头，因为发酵液为半透明液体，光谱的采集方式为透反射方式，同时采集发酵液漫反射和透射混合光谱，得到更多的成分信息。光纤探头配备有反射镜，以实现上述功能。所述的PLC控制器具有三个功能：实现光谱仪的在线启停控制；实现温度、pH值等传统信号的采集和工况反馈信号的采集；实现冲洗装置的启停控制。所述的工控机用于光谱数据的存储，过程监控画面的显示，所开发的化学计量程序的运行和监控数据的存储。所述的冲洗装置喷口位于光纤探头与反射镜之间，吸取发酵液，对光纤探头的光学部件进行冲洗，防止光纤探头与反射镜间的狭小缝隙出现发酵物质的附着和沉淀，影响发酵液光谱的采集。

所述的软件部分分为PLC控制程序和上位机程序两部分。PLC程序主要包括三个部分。第一部分：发酵罐中温度、pH、溶氧、冷却水流量和出入口温度检测，以上参数都为模拟量，使用模拟量采集模块进行采集。第二部分：葡萄糖流加阀门状态信号、前体补充阀门状态信号、补氮阀门状态信号的采集，这些状态信号都为开关量，使用数字量采集模块采集。第三部分：光谱仪和冲洗系统的启动，光谱的采集可以使用自动采集或人工控制方式。自动方式下，光谱仪处于待机状态，PLC每隔10分钟控制光谱仪采集一次数据；人工方式下，实现人为控制光谱采集。在每次采集前，PLC控制冲洗系统启动，对光纤探头进行冲洗10s，使光路部分保持洁净。PLC所采集各模拟量和数字量信号发送至上位机等待处理。

所述的上位机程序部分，分为四个模块，第一模块是光谱采集存储程序，此程序应 为光谱仪生产厂家所编写，实现对光谱的快速傅里叶变换处理。第二模块为实现发酵工况判别的聚类判别分析算法和多模型切换程序，此程序一方面采用化学计量学判别分析方法，对发酵过程的工况进行初步判断；另一方面程序将PLC所发送的发酵罐温度、pH、通气量、各阀门开关状态加以综合，并结合程序所记录发酵时间，对当前时刻发酵罐中的发酵工况进行精确的判断，确定子模型的切换和使用。第三模块为化学计量学的回归分析算法，对发酵罐中的生物量、青霉素浓度、含糖量、含氮量进行分析，并记录数据。第四模块为上位机监控程序，用来显示测量以及计算所得的各种生化信号，并实现存储、报表以及打印的功能。

本发明与目前缺乏的技术相比，优点是：

1.本发明可以实现对青霉素发酵过程中传统方法无法测量的指标的在线检测，如含糖量、含氮量、生物量和青霉素浓度等。可以实现多种理化指标同时、快速检测，采集一次光谱，得到多种数据。可以部分取代传统的检测方法，提高青霉素发酵过程监控的自动化水平。

2.本发明采用多模型方式，将整个发酵过程详细的分为不同的工况，对于不同工况以不同的子模型来加以适应，提高了检测的精度。采用子模型自动切换策略，根据发酵过程当前时间以及过程中的可直接测量变量，得到当前工况的详细信息，实现模型的自动切换。

3.本发明可通过以太网或现场总线与原有DCS系统进行简便综合，无需对已有计算机控制系统进行复杂的改造，节省投资成本。

四、附图说明

图1是本发明基于近红外光谱分析技术的青霉素发酵过程监控系统的硬件架构图

图2是本发明中程序算法流程图

图3是本发明中所涉及的青霉素发酵过程生物量变化曲线图

图4是本发明中多模型化学计量回归方法示意图

图5是本发明中光纤探头细节图

五、具体实施方式

下面结合附图和实例讲解对本发明作进一步的说明和解释，可使本领域的相关技术人员更好的理解本发明。

图1提供了本发明所述系统的硬件结构图，其工作原理为：光谱仪与工控机通过专用USB接口相连，与PLC通过RS232口相连；PLC与工控机也通过RS232口相连，实现相互之间的通讯。光谱仪所配备光纤探头插入发酵罐罐体中部30cm，并安装配备冲洗装置。采用PT100热电阻进行温度检测，配有相应温度变送器，输出信号4-20mA，共三路，分别为发酵罐温度，冷却水入口温度，冷却水出口温度。采用工业在线pH计进行pH信号的采集，输出信号4-20mA。使用工业电磁流量计进行冷却水流量的检测，输出信号4-20mA。所得5个模拟量信号进入PLC模拟量输入模块。葡萄糖流加阀门状态、 前体补充阀门状态、补氮阀门状态等三个开关量信号，直接采用电磁阀自带阀位反馈信号，进入PLC数字量输入模块。光谱仪的启动信号通过PLC数字量输出模块进行输出，启停的反馈信号经由数字量输入模块反馈至PLC。

系统的运行过程如下：发酵过程开始，PLC上电，光谱仪开机并处于待机状态。10分钟后，对发酵罐内发酵液光谱进行第一次测量，测量前进行10s冲洗。冲洗完毕等待30s，待发酵液流动均匀时开始光谱采集。采集过程由光谱仪自动完成。光谱数据采集完成后发送至工控机，在工控机内完成光谱预处理，发酵工况判别，回归分析等过程，得到所需生化指标。将所需参数存储并予以显示，生成状态曲线，完成一次采集过程。后续每隔一定时间，进行一次光谱采集与分析，时间间隔可人为设定。光谱重复采集次数也可人为根据经验进行选取。

整个系统程序控制过程如图2所示，其中PLC程序部分单独标出，PLC程序中包含光谱仪控制程序块，模拟量信号采集程序块，开关量信号采集程序块，冲洗装置控制程序块四个部分。光谱仪控制程序块与冲洗装置控制程序块为简单的开关量控制。模拟量、开关量信号采集程序块简单使用PLC内部寄存器实现。根据前文的描述，配合工控机实现信号的采集以及所需的开关量控制。

光谱数据的处理在工控机中完成。光谱数据采集后，首先经过光谱预处理，然后使用判别分析算法进行子模型归属判断，与模型中预存的几种子模型的光谱进行对比，初步确定当前光谱的子模型归属。此后，将初步确定的子模型状态与使用各种数字量、模拟量信号所达成的工况判断结论进行综合，在时间标尺的辅助下，精确确定此时的工况。根据判定的工况，在多模型回归算法中调用匹配的子模型。将预处理的光谱数据导入子模型，经回归分析计算出生物量，含糖量、含氮量和青霉素浓度四个指标。最后，上位机软件对所测得参数进行显示和归档。

图3表示了青霉素发酵过程中生物量的变化曲线。由图中曲线可以看出，青霉素发酵过程可以大致分为5个阶段：延迟期、加速期、对数期、减速期、停滞期，其中停滞期后为死亡期，细胞溶解，发酵液品质变差，因此死亡期之前，就要完成放罐。延迟期、加速期和对数期共约60小时，其后为减速期和停滞期。由于青霉素发酵使用的是分批补料发酵方式，因而在对数期中就开始进行多次的补料以及补充氮源，每次新物质的加入都会使模型特性发生变化。因此，针对青霉素发酵整个过程中的不同时期和分批补料的特点，本发明中采用了多模型建模方式。初步将子模型设置如下：延迟期为子模型1，加速期为子模型2，进入对数期到补糖之前为子模型3，补糖后与补氮之前一段为子模型4，补氮之后为子模型5，减速期为子模型6，停滞期前期为子模型7，停滞期后期至放罐前为子模型8。在系统的初始设计阶段，对应于每个工况，建立相应的子模型。当系统投入在线检测时，根据工况判别情况对子模型进行调用和分析。

图4表示子模型的组成方式。如图所示，未知光谱首先经预处理，然后进行工况的初步判别，得到所属的子模型序号，接着程序调用其所对应的子模型，每个子模型都是由PLS偏最小二乘回归方法进行建模。未知光谱经模型计算，得到最终生化指标的值。 快速迭代偏最小二乘NIPALS回归计算速度快，占用内存小，是一种理想的在线分析算法。

图5为本发明中光纤探头的安装细节图。为得到发酵罐体中准确的信息，光纤探头插入罐体30cm，发出并接收近红外光。正对光纤探头，使用不锈钢支架支撑一块平面镜，与光纤探头的间隙为5mm，用以构建近红外光的透反射光路。光纤和平面镜间狭缝的正上方，是冲洗装置的喷嘴，冲洗装置采用微型直流水泵实现，直接吸取发酵罐中发酵液，并以高速喷出，冲洗狭缝，将其中沉积的物质清除。这种设计可以防止在狭缝处产生物质堆积，影响光谱测量。

本系统模型的建立过程在产品初始设计阶段完成，不需要使用者自己建立模型。以下内容是对模型前期建立过程的进一步说明。

系统中所使用判别分析模型和回归模型都是前期离线建立的。前期建模需要对多个批次的完整发酵过程进行数据采样，采集所需的光谱和发酵液成分浓度信息。整个青霉素发酵过程需要大约200小时，在此过程中每隔6分钟进行一次采样，共采集2000个样本。对所采集的样本使用国标方法检测其中生物量、含糖量、含氮量和青霉素含量，并离线采集近红外光谱。所采集的数据，在后续的建模阶段作为模型输入。上述发酵过程需要采取典型的发酵工艺，扩大模型的普适性。

光谱的预处理过程也需要采用多种不同方法的配合。首先进行归一化处理；接着进行多元散射校正(MSC)，消除发酵液中颗粒物和气泡对光谱的影响；然后采用一阶导数+Savitzky-Golay卷积平滑处理，使光谱有效信息更为突出。为了不丢失有效的信息，并减少截取光谱的计算，本模型中使用全光谱进行判别和回归。

判别分析模型只需要光谱数据。前期离线建模时，首先将经过预处理的2000个样本光谱进行系统聚类分析，划分出样本的谱系图，在谱系图的基础上，对所用子模型的数量进行小幅调整，最终确定子模型数量n。然后采用无监督的模式识别方法，选定n个聚类中心，进行聚类。因为青霉素发酵过程为一个连续的过程，各类别的分界不够清晰，因而在本发明中采用模糊K均值聚类方法将2000个样本聚成n类，这些类别基本是按照发酵时间的先后顺序聚集在一起，计算每类的中心和边缘样本的位置。当在线测量时，考虑计算速度，则采用最小距离判别法，分别计算当前所采集光谱与每一类别聚类中心之间的马氏距离，并将当前光谱归结为马氏距离最小的一类。当出现当前光谱与两类中心马氏距离都相等的情况，则计算所测样本和两个类别最边缘样本的马氏距离，并由此距离大小判定其归属。

马氏距离的计算公式为，

工业级的发酵需要高度的可靠性，然而判别分析得到的子模型归属可能会出现误差，需要将其结果和发酵过程参数状态加以综合和对比，最终得到确定的子模型归属。由青霉素发酵过程的经验可知，发酵前60小时为菌丝生长期，温度控制为26℃，pH值控制 为6.8-7.2。后140小时为青霉素合成期，温度控制为24.7℃。pH值控制为6.5。第10小时左右，进行补加葡萄糖。发酵单位升至2500U.mL^-1补加前体。PLC采集每一次的加料动作和温度、pH的变化，将这些数据与发酵时间相结合，判断出此时此刻发酵过程所处的工况，再对应判别分析的结果，准确判定子模型的编号。

回归模型建立在聚类结果的基础上，本发明中采用最为稳健而快速的偏最小二乘回归模型PLS。偏最小二乘回归的基本思想是对光谱矩阵X和成分含量矩阵Y进行分解，分别计算载荷和矩阵和得分矩阵。

其中，P为X矩阵的载荷矩阵，T为X矩阵的得分矩阵，Q为Y矩阵的载荷矩阵，U为Y矩阵的得分矩阵。

然后对U和T矩阵进行最小二乘回归。

U＝TB (3)

则乘积PBQ即为光谱对应浓度的回归系数。

对于每个子模型，需要针对三种不同成分求取三个回归系数。

实际的在线监测过程中，只需输入当前时刻的光谱数据值，就可得出此时所需测量的生物量、青霉素浓度等信息。

Y_未知1＝X_未知PBQ₁ (4)

如上所述，完整的基于近红外光谱分析技术的多模型青霉素发酵过程监控系统是一个有机的整体，通过合理的硬件搭建和软件编写，实现对传统检测方法中所不能获得信号的快速、精确检测。另外值得一提的是，本系统可以和发酵生产线中原有的DCS自动控制系统兼容并配合，或者作为原DCS系统的一部分，实现系统的完美集成，有效提高发酵过程的自动化水平，对从事青霉素发酵工程的技术人员带来极大的帮助。