检测RHBDD1蛋白的ELISA方法及试剂盒与流程

本发明涉及检测rhbdd1蛋白的elisa方法和试剂盒。进一步地，本发明涉及检测血清、细胞培养上清或细胞裂解液中的rhbdd1蛋白的elisa方法和试剂盒。

背景技术：

rhbdd1基因(genbank登录号:ay640233)在人体中表达的蛋白全长为315个氨基酸，含有四个跨膜结构域，其215-315位氨基酸为一段高度亲水区。蛋白结构域分析表明，在其31-214位氨基酸含有一个高度保守的rhomboid结构域，故该蛋白属于rhomboid蛋白酶家族成员。研究表明，rhbdd1蛋白表达可能在促进细胞周期，癌症发生中发挥特定作用。

在本发明人之前的专利(中国专利申请201110310766.6，公开日2012年2月22日)中描述了源自rhbdd1的蛋白及其单克隆抗体的制备，该专利的全部内容并入本文作为参考。

目前市面所售的检测rhbdd1蛋白的elisa试剂盒，大多数针对鼠源rhbdd1蛋白，极少数提及可尝试用于人源rhbdd1的检测。对于在肿瘤生物学中研究逐渐深入且功能较强的rhbdd1蛋白质，在转化应用研究中存在极大的缺陷。本发明人令人惊奇地发现，采用双抗体夹心elisa检测法，能够特异且高敏感的检测人源rhbdd1的表达，对于其在血清、细胞培养上清、细胞裂解液组分中的表达量能够采用elisa法进行精确定量。

技术实现要素：

一方面，本发明提供了一种用于检测rhbdd1蛋白的elisa方法，所述方法包括以下步骤：

1)获得待测样品；

2)稀释包被抗体；

3)将步骤2)中稀释的包被抗体加入固体支持物中过夜孵育；

4)封闭；

5)稀释待测样品、标准品和酶标抗体；

6)将步骤5)稀释的待测样品或标准品加入固体支持物；并加入

步骤5)稀释的酶标抗体，过夜孵育；

7)洗涤固相支持物；

8)加入显色液显色，并检测od450、od630值。

根据本发明所述的用于检测rhbdd1蛋白的elisa方法，其中包被抗体和酶标抗体为识别的人源rhbdd1蛋白215-315位氨基酸表位的多克隆抗体和单克隆抗体；其中，rhbdd1蛋白215-315位氨基酸序列参见中国专利申请201110310766.6。

进一步地，根据本发明所述的用于检测rhbdd1蛋白的elisa方法，其中具有包被液的ph值为8.5-6.5，优选为7.4。

进一步地，根据本发明所述的用于检测rhbdd1蛋白的elisa方法，其中包被抗体浓度为1.25-2.25ng/μl，优选为1.6-2.0ng/μl，更优选为1.75ng/μl。

进一步地，根据本发明所述的用于检测rhbdd1蛋白的elisa方法，其中所述待测样品稀释1-5倍。

进一步地，根据本发明所述的用于检测rhbdd1蛋白的elisa方法，其中标准品稀释液为1％bsa+5％甘油+pbs(7.4)，抗体稀释液为2％bsa+pbs，其中使用tam法显色。

进一步地，根据本发明所述的方法，用于检测血清、细胞培养上清或细胞裂解液中的人源rhbdd1蛋白。

本发明提供了一种用于检测rhbdd1蛋白的elisa试剂盒，所述试剂盒包含针对rhbdd1蛋白215-315位氨基酸表位的单克隆抗体和多克隆抗体。

本发明还涉及针对rhbdd1蛋白215-315位氨基酸表位的单克隆抗体和多克隆抗体在制备用于检测rhbdd1蛋白的elisa试剂盒中的用途。

本发明还涉及针对rhbdd1蛋白215-315位氨基酸表位的单克隆抗体和多克隆抗体在制备用于诊断结肠直肠癌和/或用于监测结肠直肠癌疾病进程的elisa试剂盒中的用途。

附图说明

图1显示使用针对人源rhbdd1的鼠单克隆抗体26#和兔多克隆抗体665#的westernblot检测结果，其中+/+表示hct-116wt细胞，-/-表示hct-116rhbdd1敲除细胞。

图2显示亲和纯化rhbdd1215-315位氨基酸截短体蛋白的考马斯蓝染色结果。

图3显示采用纯化得到的rhbdd1215-315位氨基酸截短体蛋白绘制的elisa法检测rhbdd1的标准曲线。

图4a-4b：结直肠癌病人血清rhbdd1检测结果。图4a：结直肠癌41例，结直肠癌术前57例(不与41例重叠)，结直肠癌术后57例(与术前对应)，健康对照150例，散点图。图4b：柱形图。

图5a-5b：结直肠癌病人血清rhbdd1检测结果。图5a：结直肠癌98例(为图4a-4b中41+57例)，健康对照150例，散点图。图5b：柱形图。

图6a-6b：结直肠癌病人血清rhbdd1检测结果。图6a：结直肠癌术前57例，对应的结直肠癌术后57例，散点图。图6b：柱形图。

具体实施方式

双抗体夹心elisa检测法，是检测抗原最常用的elisa，适用于检测分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原。其基本工作原理是：利用连接于固相载体上的包被抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合，在反应系统中形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物。包被抗体和酶标抗体的量相对于待测抗原是过量的，因此复合物的形成量与待测抗原的含量成正比(在方法可检测范围内)。测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量(od值)，即可确定待测抗原含量。

本发明的方法能够特异且高敏感的检测人源rhbdd1的表达，对于其在血清、细胞培养上清、细胞裂解液组分中的表达量采用elisa法进行精确定量。弥补了目前人源rhbdd1的elisa检测方法的缺失。

本发明所采用的elisa条件筛选如下详述。

1、包被液的选择

包被抗体浓度：1.75ng/ul

ph9.6碳酸盐缓冲液：

na2co31.59克

nahco32.93克

加蒸馏水至1000ml

ph7.4磷酸盐缓冲液：

封闭液：包被液+0.5％bsa

标准品稀释液：pbs(7.4)

标准品浓度设置：

250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125、3.9、1.95、0。

抗体稀释液：pbs(7.4)+2％bsa

洗涤液：pbs(7.4)+0.05％tween-20

显色液：碧云天(p0209)

结果表明ph7.4包被效果较好，曲线在0-62.5ng/ml范围内具有较好的线性。

2、包被抗体浓度及标准曲线范围的选择：

1.75ng/μl包被及标准品浓度设置：

0、0.4875、0.975、1.953125、3.90625、7.8125、15.625、31.25、46.875、62.5。

0.87ng/μl包被及标准品浓度设置：

250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125、3.9、1.95、0。

包被液：ph7.4磷酸盐缓冲液

封闭液：包被液+0.5％bsa

标准品稀释液：pbs(7.4)

抗体稀释液：pbs(7.4)+2％bsa

洗涤液：pbs(7.4)+0.05％tween-20

显色液：碧云天(p0209)

结果表明1.75ng/μl包被及标准品浓度设置(0、0.4875、0.975、

1.953125、3.90625、7.8125、15.625、31.25、46.875、62.5)具有较好的线性。

3、血清稀释度的优化：

小样本血清尝试，稀释：10倍、5倍、2倍、原液

包被液：ph7.4磷酸盐缓冲液

封闭液：包被液+0.5％bsa

标准品稀释液：pbs(7.4)

血清稀释液：pbs(7.4)

抗体稀释液：pbs(7.4)+2％bsa

洗涤液：pbs(7.4)+0.05％tween-20

显色液：碧云天(p0209)

所得结果血清1-5倍稀释后，rhbdd1含量位于标准曲线合适的范围内，且最能反映不同样本间表达量的差异。

4、标准品(血清)稀释液的优化：

包被液：ph7.4磷酸盐缓冲液

封闭液：包被液+0.5％bsa

抗体稀释液：pbs(7.4)+2％bsa

洗涤液：pbs(7.4)+0.05％tween-20

显色液：碧云天(p0209)

所得结果增加保护剂后，a配置方法线性最好；并且在1周后、3周后的检测结果表明，a配置方法线性最好，稳定性高。

5、显色剂的选择：

opd(邻苯二胺)法：

底物用磷酸－柠檬酸缓冲液(ph5.0)

a液：柠檬酸(无水)1.92g加去离子水到100ml

b液：na2hpo4·12h2o7.16g加去离子水到100ml

取2.43ml(a)+2.57ml(b)+5ml去离子水混合即为所需溶液。

新鲜配制：30％h2o215μl+邻苯二胺4mg+9.985ml磷酸－柠檬酸缓冲液。

tam(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)法：

底物用磷酸－柠檬酸缓冲液(ph5.0)

a液：柠檬酸(无水)1.92g加去离子水到100ml

b液：na2hpo4·12h2o7.16g加去离子水到100ml

取2.43ml(a)+2.57ml(b)+5ml去离子水混合即为所需溶液。

新鲜配制：50ultmb(10mgtmb溶于1mldmso中)溶液+10ml底物缓冲液+10ul30％h2o2。

包被液：ph7.4磷酸盐缓冲液

封闭液：包被液+0.5％bsa

标准品稀释液：pbs(7.4)

抗体稀释液：pbs(7.4)+2％bsa

洗涤液：pbs(7.4)+0.05％tween-20

所得结果表明tam法显色效果较好，opd法整体阳性信号弱，不利于检测。

6、血清rhbdd1的elisa检测法：

试剂：

包被液：

ph7.4磷酸盐缓冲液：

封闭液：包被液+0.5％bsa

标准品稀释液：pbs(7.4)+1％bsa+5％甘油

血清稀释液：pbs(7.4)+1％bsa+5％甘油

抗体稀释液：pbs(7.4)+2％bsa

洗涤液：pbs(7.4)+0.05％tween-20

显色液：tam(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)法，

底物用磷酸－柠檬酸缓冲液(ph5.0)

a液：柠檬酸(无水)1.92g加去离子水到100ml

b液：na2hpo4·12h2o7.16g加去离子水到100ml

取2.43ml(a)+2.57ml(b)+5ml去离子水混合即为所需溶液。

新鲜配制：50ultmb(10mgtmb溶于1mldmso中)溶液+10ml底物缓冲液+10ul30％h2o2。

终止液：5.6％h2so4/ddh20(v/v)

检测步骤：

1)包被，665#抗体以4℃预冷的包被液稀释(ph7.4)，最终包被浓度为1.75ng/ul；采用200ul包被液(含稀释后的抗体)/96孔板的孔，加入预冷的96孔板中，4℃过夜包被。

2)封闭，次日弃去包被液，加入封闭液350-400ul/孔，室温封闭2h。

3)标准品设置为(单位ng/ml)

标准品10倍稀释使用(利于保存)，血清1-5倍稀释使用；弃去封闭液，分别在相应孔内立即加入稀释后的标准品或血清，100ul/孔。

4)加入酶标抗体，以抗体稀释液稀释26#单克隆抗体，工作浓度1ug/ml；稀释后的抗体以100ul/孔加入相应孔内，轻摇混匀后，置96孔板于4℃反应过夜。

5)洗涤，次日弃去板内液体，加入洗涤液350-400ul/孔，加满后弃去，如此清洗至少五次。

6)显色，加入新鲜配置的显色液，200ul/孔，于室温(或37℃)显色15-20min后(37℃反应时间适当缩短)，加入终止液终止反应，100ul/孔。

7)检测：立即于酶标仪检测od450、od630。

7、标准品rhbdd1的制备

通过原核表达并纯化得到高纯度的rhbdd1215-315位氨基酸的截短体，利用此截短体绘制rhbdd1含量的标准曲线，用以血清中蛋白的准确定量。亲和纯化rhbdd1截短体蛋白考马斯蓝染色结果显示于图2中。

采用纯化得到的rhbdd1截短体蛋白进行标准曲线的绘制，标准品设置为：60、45、30、15、7.5、3.75、1.875、0.9375、0。elisa法检测rhbdd1的标准曲线显示于图3。

8、临床病人血清的rhbdd1的检测

使用26#单克隆抗体(参见中国专利申请201110310766.6)与兔多克隆抗体665#，对以下病人血清进行elisa检测；其中，结直肠癌41例，结直肠癌术前57例(不与41例重叠)，结直肠癌术后57例(与术前对应)，健康对照150例。

其中，26#单克隆抗体是由人源rhbdd1蛋白215-315位氨基酸所形成的肽片段免疫小鼠而获得的单克隆抗体。所述665#兔多克隆抗体665#的制备方法如下：

步骤1：rhbdd1的215-315氨基酸的重组蛋白的原核大量表达

1)经过鉴定的阳性质粒保存平板中挑单菌落加入100ml新鲜的含相应抗生素的lb锥形瓶中。37℃剧烈摇动培养过夜。

2)将过夜菌液按1/20比例接种到500ml含相应抗生素的lb锥形瓶中，37℃剧烈摇动培养，至菌液的od600nm值达0.6～0.8。

3)加入适当浓度的iptg诱导表达3～4小时。

4)收集培养液，5000rpm离心10分钟，弃上清。pbs(138mmol/lnacl,2.7mmol/lkcl,10mmol/lna2hpo4,1.8mmol/lkh2po4)洗菌体沉淀。

5)按照5ml/g(约为菌液体积的1/25，即20ml)的量用pbs(或结合缓冲液，见3.1)重悬菌体沉淀，冰浴下以工作10秒/冷却20秒/300w/25次的参数，超声破碎细胞。12000rpm离心20分钟，分别取少量上清(含可溶形式表达蛋白)和沉淀(含包涵体蛋白)，进行sds-page检测，分析蛋白质在胞内表达形式。其余于-70℃冻存备用。

步骤2：rhbdd1的215-315氨基酸的重组蛋白的ni-nta亲和纯化

1)ni柱平衡：用5倍柱床体积的bindingbuffer(25mmtris-clph8.0，500mmnacl，10％glycerol，0.1％triton，1mmβ-mercaptoethanol，1mmpmsf)洗柱。

2)上样：当bindingbuffer下降到柱床上缘时，将可溶性融合蛋白质，以0.45μm滤膜过滤，上样。

3)杂蛋白洗涤：分别以10倍体积的bindingbuffer、6倍体积的washingbuffer(25mmtris-clph8.0，500mmnacl，40mmimidazole，10％glycerol，1mmβ-mercaptoethanol)洗脱杂蛋白。

4)目的蛋白洗脱：降低流速，以6倍柱床体积或更少的elutebuffer(25mmtris-clph8.0，500mmnacl，300mmimidazole，10％glycerol，1mmβ-mercaptoethanol)洗脱柱子。收集洗脱液。取少量进行sds-page鉴定。

步骤3：sds-page方法纯化目的蛋白质

1)将大板胶玻璃片洗干净、晾干，用凡士林涂抹挡胶片，组装大板胶胶板。用橡皮胶封闭胶底，夹子夹紧胶板，竖立放置。

2)用1×tae配制1％琼脂糖，充分煮沸后倒入组装好的大板胶底部至约1～2cm高，静置冷却。之后用70％乙醇测试胶底是否密封完全。

3)测试如果胶底密封完全，依据sds-page的配方配制10％的分离胶(50ml)，加入大板胶胶板内后用70％乙醇封胶，静置1h以上。倒去乙醇，配制浓缩胶(5～10ml)，70％乙醇封胶，静置15min以上。

4)将乙醇倒去后，将胶底的橡皮胶卸去，将大板胶装入电泳设备之中(注意防止电泳负极的密封性，防止电泳buffer的渗漏)。

5)小心地将抗原蛋白样品加入上样槽中(每块厚大板胶5-10mg蛋白样品)，之后小心地在上样槽中补满电泳缓冲液，将正负极的电泳缓冲液全部补齐，开始电泳100v。

6)如果需要过夜电泳，需将电泳的电压调至60v左右。

7)待电泳溴酚蓝至底部，停止电泳，拆卸胶板。用1ml枪均匀加入显胶液(2mkcl)至胶面，至光亮处仔细观察是否有乳白色胶条带出现(注意，溴酚蓝以下的亮白色胶带不是蛋白所产生的，不能误切)。如发现，立即用干净的手术刀切割后移至干净的50ml离心管中-20℃保存。如未能发现，将胶放置于4℃中数分钟后再观察(通常在刚开始加入显胶液既能发现蛋白条带)。

8)在冷室中，将切割好的胶带转移至一干净的研钵中，加入少量的溶胶液后用研钵捣碎胶带，反复充分研磨约20min左右至胶完全研碎。

9)将研磨好的样品转移回离心管中，用溶胶液洗涮研钵后补入离心管中至总体积为40ml左右。将离心管用封口膜封紧，在4℃摇床下过夜摇匀(12～24h)。

10)将离心管在5000rpm，4℃下离心10min，吸取上清转入15mlmilliporesuperflowtube浓缩(剩余的胶沉淀可再加入一定体积的溶胶液后继续溶析蛋白)，至蛋白浓度超过1mg/ml。将蛋白样品中加入80％甘油至甘油终浓度达到10％，-80℃保存。

步骤4：兔多克隆抗血清的制备

取2只约2kg重的雄性新西兰大白兔，用苦味酸在兔身上作标记。免疫前从耳缘静脉取血1ml，提取正常血清作为对照。

1)第一次基础免疫：500μg抗原(纯化融合蛋白)加等体积福氏完全佐剂混合，直至形成均匀油包水状乳液，采用背部皮内多点注射，约20～30点。对照组取泡胶液与福氏完全佐剂混合，按照相同的方法注射；

2)第二次基础免疫：(第一次免疫后的第三天)500μg抗原加等体积福氏完全佐剂混合，背部皮内多点注射。免疫7天后，从耳缘静脉取血，提取血清进行elisa测定抗体效价；

3)第三次加强免疫：500μg抗原加等体积福氏不完全佐剂混合，背部皮内多点注射。一周后使用elisa方法测定抗体效价，如果效价达到要求则准备收集血清；如果效价较低，则需要进行第四次加强免疫，直到抗体效价达到所需滴度；

4)从颈动脉放血，采集的血液于室温斜置30min,移到4℃冰箱过夜，待血清析出后，1000rpm离心10min收集血清，分装后-70℃保存备用。

步骤5：抗血清的抗原亲和纯化

常规法抗原亲和纯化，得到抗rhbdd1蛋白的兔多克隆抗体665#。

结果表明，所述抗体可用于进行高效而特异的elisa双抗体夹心检测法。详见图4a-4b，图5a-5b以及图6a-6b。

其中，图4a显示结直肠癌41例，结直肠癌术前57例(不与41例重叠)，结直肠癌术后57例(与术前对应)，健康对照150例，散点图。图4b为柱形图。

图5a显示结直肠癌98例(为图1中41+57例)，健康对照150例，散点图。图5b为柱形图。

图6a显示结直肠癌术前57例，对应的结直肠癌术后57例，散点图。图6b为柱形图。