一种铁棍山药中吡唑醚菌酯残留量的检测方法与流程

本发明属于农药残留检测技术领域，具体涉及一种铁棍山药中吡唑醚菌酯残留量的检测方法。

背景技术：

吡唑醚菌酯是BASF公司于1993年发现、2001年登记上市的甲氧基丙烯酸酯类醌外抑制型杀菌剂。主要通过阻止细胞色素bc1复合体的电子传递进而抑制线粒体呼吸作用，使线粒体不能产生和提供细胞正常代谢所需要的ATP，最终导致细胞死亡，具有保护、治疗和叶片渗透传导作用。会引起像推迟衰老、叶片变绿、对生物和非生物胁迫耐受性更好等生理效应，能更有效地利用水和氮。吡唑醚菌酯具有广谱、高效、毒性低，对非靶标生物安全，对使用者和环境安全友好、对作物安全性好等特点， 有研究表明吡唑嘧菌酯还有保健增产的作用。自上市以来其已在100多种作物上登记使用，主要用于防治如谷物的山药壳针孢、柄锈病、山药德斯霉菌、杆圆核腔菌、黑麦喙孢菌和麦颖枯病，花生的球腔菌，大豆的线虫病、思茅松毛虫病和大豆锈菌，葡萄的霜霉病和白粉菌，马铃薯和番茄的疫霉病和早疫病，黄瓜的霜霉病和白粉病，香蕉的黑条叶斑病菌，柑橘的痂囊腔菌和球座菌，草坪的纹枯病和腐霉菌。

国内外对吡唑醚菌酯的残留测定方法已有大量报道。吴迪等建立了凝胶渗透色谱结合氨基柱净化、高效液相色谱检测的方法；周先学等建立了高效液相色谱/VWD快速检测苹果和土壤中吡唑醚菌酯残留量的方法；闫晓阳等建立了固相萃取、高效液相色谱/DAD检测烟叶和土壤中吡唑醚菌酯的方法；De Melo Abreu等建立了同时检测葡萄和葡萄酒中6种杀菌剂的高效液相色谱检测方法；Fulcher等利用DSPE/HPLC-UV法分析了吡唑醚菌酯在甘蔗土壤中的残留；Esteve-Turrillas等开发了一种通过免疫亲和色谱柱提取，然后用HPLC-UV分析苹果汁和红葡萄汁中吡唑醚菌酯残留的检测方法；汤永娇等建立了氨基柱净化，超高效液相色谱/紫外检测器检测芒果中吡唑醚菌酯的方法；刘军等建立了柑橘中吡唑醚菌酯的高效液相色谱-质谱分析方法；王燕等建立了PSA固相萃取柱净化，HPLC-MS检测人参根茎叶和土壤中吡唑醚菌酯的方法；徐娟等利用QuEChERS提取，采用超高效液相色谱-电喷雾电离串联质谱在短时间内同时检测了包括吡唑醚菌酯在内的230种农药残留。然而，到目前为止还没有报道吡唑醚菌酯在铁棍山药中的检测方法。

上述检测方法的提取液多为丙酮，用量较多，后期净化复杂，环境污染严重，且提取、盐析后，多为旋转蒸发，工作效率低；有些方法前处理简单，但检测所用仪器为质谱，普及率较低，方法推广应用难，检测成本高。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种铁棍山药中吡唑醚菌酯残留量的检测方法，提取液用量较少，后期净化较简单，较少了环境污染，降低了检测成本；提取、盐析后，加热板蒸干，不需要旋蒸，提高了工作效率；检测所用的仪器为液相，普及率较高，有较强的实用性，具有很好的推广应用价值。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

一种铁棍山药中吡唑醚菌酯残留量的检测方法，步骤如下：

（1）标准溶液的制备：称取吡唑醚菌酯标准品，用乙腈溶解定容制成1000 mg/L的母液，再逐级稀释成浓度为0.05mg/L、0.1 mg/L、0.25 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L的标准溶液；

（2）绘制标准曲线：将步骤（1）制得的标准溶液过色谱柱SunFireTM C18(150 mm×4.6 mm，5 µm)后用PDA检测器检测，检测波长275 nm，柱温为25 ℃，流动相为乙腈-水，流速为1.0 mL/min，进样量为20 µL；

以标准溶液的浓度为横坐标x，峰面积为纵坐标y，计算机绘制标准曲线，标准曲线线性方程为y=86491x-426.4，其中，x为吡唑醚菌酯标准溶液的浓度，单位mg/L，y为峰面积，响应值相关系数为r²=0.9999；

（3）样品提取：将铁棍山药清洗干净后匀浆，得到样品，准确称取该样品20.00 g(精确至0.01 g)于100 mL离心管中，然后加入10 mL水和40 mL乙腈，振荡1 h后，加入5 g氯化钠，盖上盖子涡旋30 s，静置1 h，于5000 r/min的条件下离心5 min，取上清液20 mL于40℃蒸发至近干，待净化；

（4）样品净化：将步骤（3）蒸发至近干得到的残留物用5 mL正己烷和丙酮的混合溶液溶解，然后加入氨基固相萃取柱，再用15 mL正己烷和丙酮的混合溶液分3次洗脱，合并淋洗液，于40 ℃蒸干，用乙腈定容至2 mL，过0.22 μm滤膜得到样品溶液；

（5）样品检测：将步骤（4）所得的样品溶液按照步骤（2）中的液相色谱条件进行检测；

（6）结果计算：按照公式计算样品中吡唑醚菌酯的浓度；C 表示待测样品中农药残留量，mg/kg；C₀表示标准溶液浓度，μg/mL；A 表示待测样品峰面积；A₀表示标准溶液峰面积；V₀表示标准溶液进样体积，μL；V₁表示待测样品定容的体积，mL；V₂表示待测样品的进样体积，μL；M 表示待测样品的质量，g。

所述步骤（4）中正己烷和丙酮的混合溶液中正己烷和丙酮的体积比为3:2。

所述步骤（4）中的氨基固相萃取柱预先经过5 mL正己烷和丙酮的混合溶液预淋洗，其中正己烷和丙酮的体积比为3:2。

所述步骤（2）中流动相乙腈-水的体积比为70：30。

本发明的有益效果：1、本发明以乙腈作为提取液，与已报道的丙酮作为提取液相比后期净化较简单；2、与甲醇作为提取液相比，提取、盐析后，加热板蒸干，不需要旋蒸，能提高工作效率；3、检测所用的仪器普及率较高，方法易推广应用；4、本发明检测方法的重现性，准确度、精密度及检出限均可满足该农药在铁棍山药上的残留分析要求；5、本发明检测方法较少了环境污染，降低了检测成本，提高了工作效率，有较强的实用性，具有很好的推广应用价值。

附图说明

图1为本发明实施例中吡唑醚菌酯标准曲线。

图2为0.05 mg/L吡唑醚菌酯标准溶液色谱图。

图3为0.1mg/L吡唑醚菌酯标准溶液色谱图。

图4为0.25 mg/L吡唑醚菌酯标准溶液色谱图。

图5为0.5 mg/L吡唑醚菌酯标准溶液色谱图。

图6为1mg/L吡唑醚菌酯标准溶液色谱图。

图7为2mg/L吡唑醚菌酯标准溶液色谱图。

图8为铁棍山药中吡唑醚菌酯添加量为0.05 mg/kg的色谱图。

图9为铁棍山药中吡唑醚菌酯添加量为0.5 mg/kg的色谱图。

图10为铁棍山药中吡唑醚菌酯添加量为1mg/kg的色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围，该领域的技术熟练人员可以根据上述发明的内容作出一些非本质的改进和调整。

本发明的铁棍山药中吡唑醚菌酯残留的检测方法，具体步骤如下：

一、测定铁棍山药中吡唑醚菌酯的含量

（1）标准溶液的制备：称取一定量的吡唑醚菌酯标准品，用乙腈溶解定容制成1000 mg/L的母液，然后用乙腈定容并逐级稀释成所需浓度的标准溶液进行测定，工作曲线浓度：0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.0 mg/L；

（2）标准曲线的绘制：将步骤（1）制得的标准溶液过色谱柱SunFireTM C18(150 mm×4.6 mm，5 µm)后用PDA检测器检测，检测波长275 nm，柱温为25 ℃，流动相为乙腈-水（v/v=70:30），流速为1.0 mL/min，进样量为20 µL；

以溶液浓度为横坐标x，峰面积为纵坐标y，计算机绘制标准曲线，标准曲线线性方程为y=86491x-426.4，其中，x为吡唑醚菌酯浓度，单位mg/L，y为峰面积，响应值相关系数为r²=0.9999，见图1，最小检出量为0.1 ng，最低检测浓度均为0.05 mg/kg，相对保留时间约为7.0 min；

（3）样品提取：将铁棍山药清洗干净后匀浆，得到样品，准确称取该样品20.00 g (精确至0.01 g)于200 mL玻璃瓶中，加10 mL水，40 mL乙腈，于恒温振荡器下振荡1 h后，过滤至已加入5 g氯化钠的具塞量筒中，剧烈震荡，静置1 h，取上清液20 mL于40 ℃蒸发至近干，待净化；

（4）样品净化：将蒸发至近干得到的残留物用5 mL正己烷+丙酮(3:2，V/V)溶解加入已经过5 mL正己烷+丙酮(3:2，V/V)预淋洗的氨基固相萃取柱，收集淋洗液，再用15 mL正己烷+丙酮(3:2，V/V)分3次洗脱，合并淋洗液，于40 ℃蒸干，用乙腈定容至2 mL，过0.22 μm滤膜，移入进样瓶中，得到样品溶液；

（5）样品检测：将所得的样品溶液过色谱柱SunFireTM C18(150 mm×4.6 mm，5 µm)后用PDA检测器检测，检测波长275 nm，柱温为25 ℃，流动相为乙腈-水(体积比为70：30)，流速为1.0 mL/min，进样量为20 µL；

（6）结果计算：按照公式计算样品中吡唑醚菌酯的浓度；C 表示待测样品中农药残留量，mg/kg；C₀表示标准溶液浓度，μg/mL；A 表示待测样品峰面积；A₀表示标准溶液峰面积；V₀表示标准溶液进样体积，μL；V₁表示待测样品定容的体积，mL；V₂表示待测样品的进样体积，μL；M 表示待测样品的质量，g。

二、测定铁棍山药中吡唑醚菌酯的添加回收率

分别在已经制备好的不含吡唑醚菌酯的铁棍山药的对照样品中添加不同浓度（0.05 mg/kg、0.5 mg/kg和1 mg/kg）的吡唑醚菌酯标样溶液，摇匀，放置2h后，按照上述步骤（3）和步骤（4）所述的样品提取净化方法进行处理，按步骤（5）进行检测得到加标试样浓度，按照公式计算添加回收率，式中P 为添加回收率；C₁为试样浓度，即试样测定值（对照样品中吡唑醚菌酯的浓度）；C₂为加标试样浓度，即加标试样测定值；C₃为加标量，单位均为mg/kg。

利用上述方法测得本方法的加标回收率如下表1所示。

表1 不同添加水平时吡唑醚菌酯在铁棍山药中的回收率和相对标准偏差

由表1可知，当添加水平为0.05、0.5、1 mg/kg时，测得吡唑醚菌酯在铁棍山药中的平均回收率为77～96%，相对标准偏差为6.4～8.4%，符合残留分析要求。