本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种检测猪A型口蹄疫病毒特异性IgA抗体的方法及其检测试剂盒。
背景技术：
口蹄疫（Foot-and-Mouth Disease, FMD）是由小核糖核酸病毒科口蹄疫病毒属的口蹄疫病毒引起的一种急性、热性、高度接触性和可快速远距离传播的动物疫病，家畜感染后生产性能下降，患病仔畜死亡率高。侵染对象主要是猪、牛、羊等畜种及其它偶蹄动物，易感动物多达70余种。该病一旦暴发就会给养殖业和国际动物产品贸易带来极大的经济损失，国际动物卫生组织（OIE）将其列在15个A类动物疫病名单之首，也是我国一旦发生必须上报的一类动物传染病之一。口蹄疫病毒有O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3（即南非1、2、3型）和Asia1（亚洲1型）7个血清型。各型之间几乎没有免疫保护力，感染了一种血清型口蹄疫病毒的动物仍可感染另一血清型口蹄疫病毒而发病。在口蹄疫病毒四种结构蛋白VP1、VP2、VP3、VP4中，VP1蛋白上不仅存在主要的抗原位点（141-160aa,200-213aa和21-40aa），而且含有FMD病毒的宿主识别位点。因此选择该区域基因构建表达载体表达纯化的蛋白可以作为良好的制备抗体检测试剂盒的备选包被抗原。
IgA抗体作为黏膜免疫的主要效应因子，广泛存在于初乳、泪液、唾液等分泌液中，它不仅可以在第一时间中和病毒，而且可通过黏膜的方式进一步激活系统免疫反应，进而阻止病毒的侵入。其主要功能有:阻抑黏附，免疫排除，溶解细菌，中和病毒，介导抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用（ADCC,antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity ），抗炎症，促进天然因子作用及调节黏膜免疫反应。抗口蹄疫病毒的IgA抗体是口蹄疫病毒感染或者疫苗黏膜免疫后首先在呼吸道和消化道产生特异性的标志，同时也反应了黏膜免疫疫苗的效果。目前市场上还没有能够有效检测口蹄疫病毒特异性IgA抗体的试剂盒，鉴于近年来对黏膜免疫机制和黏膜免疫疫苗研究的深入，开发一种检测黏膜分泌物中口蹄疫病毒特异性IgA抗体水平的ELISA试剂盒，能够更加准确地反应口蹄疫病毒感染和黏膜免疫状态，同时利用该方法监测口蹄疫病毒特异性IgA抗体动态变化规律，为口蹄疫黏膜免疫效果评价和免疫程序优化提供理论依据。
技术实现要素：
本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种检测猪A型口蹄疫病毒特异性IgA抗体的方法及其检测试剂盒。
为了实现上述目的，本发明提供的技术方案为：一种检测猪A型口蹄疫病毒特异性IgA抗体的方法，以原核表达系统表达的口蹄疫病毒VP1蛋白作为包被抗原，以鼠抗猪IgA单克隆抗体为二抗，酶标记的羊抗鼠IgG抗体为指示，待检样品与包被抗原反应后，再通过单抗和酶标记抗体的进一步反应，最后与参考阳性样品和阴性样品对比，即可用来评价猪口蹄疫病毒的特异性IgA抗体水平。
进一步的，上述的一种检测猪A型口蹄疫病毒特异性IgA抗体的方法，包括以下步骤：
1)包被抗原的制备与包被：
将A型FMDV-VP1蛋白的636bP片段克隆到pET-30a(+)原核表达载体，经酶切、测序正确后，转化到E.coli BL-21(E3)，经IPTG诱导表达出VP1蛋白，用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒纯化蛋白，经该原核表达系统表达的纯化产物，用碳酸盐缓冲液将抗原稀释成3.5μg/mL，取100μl/孔的量加到96孔酶标板上，4℃包被过夜；
2)酶联板的封闭与保存：
步骤1)得到的包被过夜的酶标板用PBST洗涤4次，最后一次拍干，每孔加入100μl含6％马血清的酶标板稳定剂，室温放置30min，弃掉液体后自然晾干，采用铝箔袋真空封口，4℃保存；
3)参考阴阳性样品的制备：
采集A型口蹄疫病毒攻毒后7-21d猪的样品，经混合、一系列稀释后检测OD450值为1.5±0.05的样品为阳性；采集口蹄疫阴性猪不同时间段的样品，经混合、稀释后检测OD450值为0.1±0.05的样品为阴性，无菌分装备用；
4)二抗和酶标抗体浓缩液的制备：
鼠抗猪IgA单抗用含25％甘油的样品稀释液100倍稀释后4℃保存，HRP标记的羊抗鼠IgG抗体用酶标抗体稳定剂100倍稀释后4℃保存；
5)样品中口蹄疫病毒特异性IgA抗体的检测：
步骤2)得到的酶标板上，每孔加入稀释后的待检样品100μL，同时加入阴阳性对照各两孔，37℃孵育30min，样品稀释方法为：样品按1:2稀释，即先在稀释板中加50μl稀释液，再加50μl被检样品；取出酶标板，用PBST洗涤4次后，每孔加入100μl用样品稀释液1：100稀释的步骤4)得到的鼠抗猪IgA单克隆抗体，37℃孵育30min；取出酶标板，用PBST洗涤4次后，每孔加入100μL用样品稀释液1：100稀释的步骤4)得到的HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，37℃孵育30min；取出酶标板，用PBST洗涤4次后，每孔加入100μL的TMB显色液，室温反应10min后加入100μL/孔1moL/L的硫酸终止反应，在酶标仪上读取OD450nm值；
6)数据对比分析：
将被检样品的OD450nm值大于等于阴性平均值的2.5倍判为阳性，小于阴性平均值的2.5倍判为阴性，然后对样品阴阳性进行统计分析。
进一步的，上述的一种检测猪A型口蹄疫病毒特异性IgA抗体的方法，所述参考阳性样品是实验室攻毒后7-21天感染口蹄疫的猪的样品，阴性样品是经PrioCHECK FMDV NS试剂盒检测口蹄疫病毒非结构蛋白抗体为阴性，A型、O型、AsiaI口蹄疫液相阻断ELISA试剂盒检测血清抗体效价<1/4，FMDV特异性PCR检测抗原为阴性猪的鼻拭子；待检样品为猪的鼻拭子。
本发明的第二个目的是提供了一种猪A型口蹄疫病毒特异性IgA抗体间接ELISA检测试剂盒，所述检测试剂盒是采用上述的检测猪A型口蹄疫病毒特异性IgA抗体的方法进行检测。
进一步的，上述的猪A型口蹄疫病毒特异性IgA抗体间接ELISA检测试剂盒，所述试剂盒中包括有：预包被抗原的酶标板、阳性参考、阴性参考、样品稀释液、100倍鼠抗猪IgA单抗浓缩液、100倍酶标抗体浓缩液、PBST（10×）、TMB显色液和终止液。
本发明的技术要点为：
1、以原核表达系统表达的口蹄疫病毒VP1蛋白作为包被抗原，以鼠抗猪IgA单克隆抗体为二抗，酶标记的羊抗鼠IgG抗体为指示，待检样品与包被抗原反应后，通过单抗和酶标记抗体的进一步反应，最后与参考阳性鼻拭子和阴性鼻拭子对比，来评价猪口蹄疫病毒特异性IgA抗体水平。
2、包被抗原是经大肠杆菌pET-30a（＋）)原核表达后纯化的VP1蛋白，该蛋白含有口蹄疫病毒主要抗原位点（141-160aa,200-213aa和21-40aa），而且含有口蹄疫病毒的宿主识别位点（RGD三肽基序）。
3、二抗是鼠抗猪IgA单克隆抗体，三抗是HRP标记的羊抗鼠IgG抗体。
4、参考阳性样品是实验室攻毒后7-21天感染口蹄疫的猪的鼻拭子；阴性样品是经PrioCHECK FMDV NS试剂盒检测口蹄疫病毒非结构蛋白抗体为阴性，A型、O型、AsiaI口蹄疫液相阻断ELISA试剂盒检测血清抗体效价<1/4，FMDV特异性PCR检测抗原为阴性猪的鼻拭子。
本发明的有益效果为：本发明公开了一种检测猪A型口蹄疫病毒特异性IgA抗体的方法及其检测试剂盒，通过包被抗原、鼠抗猪IgA单克隆抗体、HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，提供了一种评价口蹄疫黏膜免疫效果的有效方法，并为口蹄疫感染的早期诊断提供了一种新方法，能够快速、准确的检测猪鼻拭子中的口蹄疫病毒特异性IgA抗体，该方法操作简便，所需时间短，可以用于大量样品的检测和黏膜免疫效果的评价，而且样品的采集操作简便，人力消耗小，对动物的应激小。
具体实施方式
本发明所用制剂来源：
96孔高亲和力酶标板：购自Coastar公司。
鼠抗猪IgA单克隆抗体：购自AbDSerotec公司。
HRP标记的羊抗鼠IgG抗体：购自Abcam公司。
酶标记抗体稳定剂：购自Sigma公司。
TMB单组份显色液：购自北京索莱宝生物科技有限公司。
10×PBST：购自北京索莱宝生物科技有限公司。
酶标板稳定剂：购自济南百迪泰生物科技有限公司。
样品稀释液：购自济南百迪泰生物科技有限公司。
实施例1：
试剂盒的制备方法：
1、包被抗原的制备与最佳包被浓度的选择：
将A型FMDV-VP1蛋白的636bP片段克隆到pET-30a（＋）原核表达载体，经酶切、测序正确后，转化到E.coli BL-21(E3),经IPTG诱导表达出VP1蛋白，用Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒纯化蛋白。经该原核表达系统表达的纯化产物，用碳酸盐缓冲液进行一系列稀释7μg/mL,3.5μg /mL,1.75μg /mL ,0.88μg /mL ,0.44μg /mL,0.22μg /mL，每个浓度包被两列，100μL/孔加到96孔酶标板上，4℃包被过夜。结果表明，包被抗原浓度为3.5μg/mL时阳性值OD450值大于1.0，且P/N的值最大，因此确定该浓度为最佳包被浓度。
VP1蛋白序列如序列表中SEQ No.1所示。
表1显示为棋盘滴定抗原工作浓度（OD450nm）。
表1
2、酶标板的封闭与保存：
上述酶标板用PBST洗涤4次，每孔加入100μl的酶标板稳定剂（含6%马血清），室温放置30min。弃掉液体后自然晾干，采用铝箔袋真空封口，4℃保存。
3、参考阴阳性样品的制备：
采集P3动物房A型口蹄疫病毒攻毒后7-21d猪（均发病）的鼻拭子，经混合、一系列稀释后经检测，样品1:4稀释后OD450值为1.5±0.05，将该批次样品无菌分装作为标准阳性；采集口蹄疫阴性猪不同时间段的鼻拭子，经混合、一系列稀释后经检测，样品1:2稀释后OD450值为0.1±0.05，将该批次样品无菌分装作为标准阴性。
4、二抗和酶标抗体工作液的选择：
用棋盘滴定法确定二抗鼠抗猪IgA单克隆抗体和三抗羊抗鼠IgG抗体的最佳工作浓度，然后用含25%甘油的样品稀释液和酶标抗体稳定剂稀释成储藏浓度1:100，4℃保存。结果表明当鼠抗猪IgA单克隆抗体1:10K稀释，HRP标记的羊抗鼠IgG抗体1:10K稀释时P/N值最大。确定二抗和三抗1:10K稀释为最佳工作浓度。
表2显示为棋盘滴定鼠抗猪IgA单克隆抗体和羊抗鼠酶标抗体工作浓度（OD450nm）。
表2
5、敏感性、特异性实验：
敏感性实验：
利用发明的间接ELISA方法检测17份直接攻毒发病后3-11d和53份同居感染第7-21天的临床鼻拭子样品，据相关文献报道口蹄疫特异性IgA抗体水平在该时间段有明显的上升趋势。ELISA检测结果也表明该时间段口蹄疫病特异性IgA抗体有很高的阳性率。说明该方法有较好的敏感性。
表3显示为间接ELISA方法检测A型口蹄疫感染猪临床样品结果。
表3
特异性实验：
用建立的间接ELISA方法检测了猪圆环病毒（PCV）特异性IgA抗体阳性样品、猪瘟病毒(CSFV)特异性IgA抗体阳性样品、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体阳性样品、猪流行性腹泻病毒感染仔猪肠黏膜冲洗液样品。鉴于我国一直存在O型口蹄疫，因此在敏感性实验中增加了O型口蹄疫感染样品，分析该方法的特异性。ELISA检测结果表明A型口蹄疫病毒特异性IgA抗体与常见猪病特异性IgA抗体没有交叉反应，但是与O型口蹄疫病毒特异性IgA抗体有一定的交叉反应，将原来的判定标准由0.25±0.05提高到0.4±0.05时，O型口蹄疫阳性率明显降低。使得敏感性由原来的98.57%降低为92.9%，但特异性由原来的56.34%提高92.96%，保证了该诊断试剂盒同时具有良好的敏感性和特异性，从根本上保证了结果的准确性和可靠性。
表4显示为猪口蹄疫病毒特异性IgA抗体间接ELISA方法的特异性实验。
表4
表5显示为间接ELISA方法检测O型口蹄疫感染猪临床样品结果。
表5
6、试剂盒的其他成分、组装及保存：
6.1试剂盒的组成：
TMB单组份显色液和10x的PBST洗涤液购自北京索莱宝生物科技有限公司。样品稀释液购自济南百迪泰生物科技有限公司。真空包装铝箔盒为定做。坐标纸一张，说明书一份。试剂盒保存在4℃冰箱中。
表6显示为猪A型口蹄疫病毒特异性IgA抗体间接ELISA检测试剂盒内容。
表6
6.2、试剂盒说明书
说明书试验布局如表7所示。
表7
样品采集要求：由于黏膜样品的采集受动物的生理状态影响较大，而且需要繁琐的标准化，故在样品采集中用镊子夹取大小基本一致的棉球，插入鼻中隔部位旋转3圈后，将鼻拭子插入事先盛有1 mLPBS（含2000单位／mL青霉素、链霉素和O.01%硫柳汞）的5 mL的离心管中，尽量避开黏稠的鼻液，若遇到猪的鼻孔中有饲料、污物等，可先用棉球拭去后再重新采集。采集的样品4℃浸润过夜后，10000min/r离心5min。分装后-70℃保存(若需长时间保存可往PBS中加入25%的甘油)。
试剂盒操作步骤：
1.加样：取出酶标板，在2孔阳性对照孔（A1、B1）直接加100μl阳性对照，2孔阴性对照孔（C1、D1）直接加100μl阴性对照。被检样品按1:2稀释，即先在被检孔内加50μl稀释液，再加50μl被检样品。37℃孵育30min。
2.加鼠抗猪IgA单抗：取出酶标板，甩掉液体，用PBST洗涤4次，最后一次吸水纸拍干。用样品稀释液将鼠抗猪IgA单抗按1:100稀释，100μL/孔。37℃孵育30min。
3.加羊抗鼠IgG-HRP：取出酶标板，甩掉液体，用PBST洗涤4次，最后一次吸水纸拍干。用样品稀释液将羊抗鼠酶标抗体按1:100稀释，100μL/孔。37℃孵育30min。
4.加TMB底物：取出酶标板，甩掉液体，用PBST洗涤4次，吸水纸拍干。加入底物溶液100μL，室温显色10min。
4.加终止液：每孔加终止液100μL，终止反应。
5.酶标仪读取OD450nm值。
计算方法：
阴阳性对照平均值计算：
阳性对照平均值=（OD-A1+OD-B1）/2；
阴性对照平均值=（OD+C1+OD+D1）/2。
试验成立条件：
两孔阳性对照OD450nm值至少一孔OD值大于1.0；两孔阴性对照至少一孔的OD450nm小于0.2。
结果判定：
被检样品大于阴性平均值的2.5倍则判为阳性，小于阴性平均值的2.5倍判为阴性。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序 列 表
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 一种检测猪A型口蹄疫病毒特异性IgA抗体的方法及其检测试剂盒
<210> 1
<211> 219
<212> PRT
<213> VP1蛋白
<400> 1
Met Thr Thr Ala Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Thr Thr Val
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Ala Gln Arg Arg Tyr His Thr Asp
20 25 30
Val Gly Phe Leu Met Asp Arg Phe Val Gln Ile Lys Pro Val Gly Pro
35 40 45
Thr His Val Ile Asp Leu Met Gln Thr His Gln His Gly Leu Val Gly
50 55 60
Ala Met Leu Arg Ala Ala Thr Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Glu Ile Val
65 70 75 80
Val Asn His Thr Gly Asn Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu
85 90 95
Ala Ala Leu Gln Asn Thr Ser Asn Pro Thr Ala Tyr His Lys Ala Pro
100 105 110
Phe Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala
115 120 125
Thr Val Tyr Ser Gly Thr Ser Lys Tyr Ser Ala Pro Gln Asn Arg Arg
130 135 140
Gly Asp Leu Gly Pro Leu Ala Ala Arg Leu Ala Ala Gln Leu Pro Ala
145 150 155 160
Ser Phe Asn Phe Gly Ala Ile Arg Ala Thr Glu Ile Arg Glu Leu Leu
165 170 175
Val Arg Met Lys Arg Ala Glu Leu Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu Ala
180 185 190
Val Glu Val Ser Ser Gln Asp Arg His Lys Gln Lys Ile Ile Ala Pro
195 200 205
Ala Lys Gln Leu Leu His His His His His His
210 215
<110> 中国农业科学院兰州兽医研究所
<120> 一种检测猪A型口蹄疫病毒特异性IgA抗体的方法及其检测试剂盒
<210> 1
<211> 219
<212> PRT
<213> VP1蛋白
<400> 1
Met Thr Thr Ala Thr Gly Glu Ser Ala Asp Pro Val Thr Thr Thr Val
1 5 10 15
Glu Asn Tyr Gly Gly Glu Thr Gln Ala Gln Arg Arg Tyr His Thr Asp
20 25 30
Val Gly Phe Leu Met Asp Arg Phe Val Gln Ile Lys Pro Val Gly Pro
35 40 45
Thr His Val Ile Asp Leu Met Gln Thr His Gln His Gly Leu Val Gly
50 55 60
Ala Met Leu Arg Ala Ala Thr Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Glu Ile Val
65 70 75 80
Val Asn His Thr Gly Asn Leu Thr Trp Val Pro Asn Gly Ala Pro Glu
85 90 95
Ala Ala Leu Gln Asn Thr Ser Asn Pro Thr Ala Tyr His Lys Ala Pro
100 105 110
Phe Thr Arg Leu Ala Leu Pro Tyr Thr Ala Pro His Arg Val Leu Ala
115 120 125
Thr Val Tyr Ser Gly Thr Ser Lys Tyr Ser Ala Pro Gln Asn Arg Arg
130 135 140
Gly Asp Leu Gly Pro Leu Ala Ala Arg Leu Ala Ala Gln Leu Pro Ala
145 150 155 160
Ser Phe Asn Phe Gly Ala Ile Arg Ala Thr Glu Ile Arg Glu Leu Leu
165 170 175
Val Arg Met Lys Arg Ala Glu Leu Tyr Cys Pro Arg Pro Leu Leu Ala
180 185 190
Val Glu Val Ser Ser Gln Asp Arg His Lys Gln Lys Ile Ile Ala Pro
195 200 205
Ala Lys Gln Leu Leu His His His His His His
210 215