本发明属于烟草制品生物学效应评价技术领域，特别涉及一种检测卷烟烟气总粒相物对细胞脂质过氧化影响的方法。
背景技术：
随着人们对健康的关注越来越高，对烟草产品提出了更高的要求，不但要有较好的口感，而且要尽可能的减少人体的不良感受。卷烟产品研发人员在烟油产品配方设计初期将不同组份按照不同比例组合调配，形成具有不同风格的初选配方，再结合化学评价和感官评价对配方进行不断筛选调整形成最终的产品配方。然而初选配方数量众多，全部进行感官评价耗时耗力，且感官评价侧重于对产品的风格口感进行筛选，如何利用生物学测试指标对产品初选配方进筛选，以获得降低人体不良感受的产品配方，目前尚属探索阶段，无统一的标准方法。
机体在遭受各种不利刺激时，体内高活性分子如活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)和活性氮自由基(reactive nitrogen species,RNS)产生过多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系统和抗氧化系统失衡，从而导致组织损伤。这种现象被称为氧化性损伤，氧化性损伤是一种广谱性损伤机制，丙二醛(MAD)是脂质过氧化的一种重要效应生物标志物，对其进行测定，可用于产品初选配方的进一步筛选，以获得降低人体不良感受的产品配方。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种检测卷烟烟气总粒相物对细胞脂质过氧化影响的方法，为电子烟制品的安全性评估提供参考。
一种检测卷烟烟气总粒相物对细胞脂质过氧化影响的方法，包括以下步骤：
(1)受试物的前处理；
(2)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的制备；
(3)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞浓度的计算；
(4)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞接种；
(5)受试物的分组；
(6)受试物检测剂量的设定；
(7)受试物培养品的制备；
(8)受试物的孵育；
(9)受试物孵育品的收集；
(10)受试物孵育品的裂解离心；
(11)标准品稀释；
(12)受试物样品测定；
(13)丙二醛含量计算。
本发明优选的实施方案中，上述的方法，包括以下具体步骤：
(1)受试物的前处理：参照中华人民共和国国家标准GB/T 19609-2004《卷烟用常规分析用吸烟机测定总粒相物和焦油》制备卷烟烟气总粒相物样品，样品浓度为10mg/mL；
(2)人肺成纤维细胞HPF单细胞悬浮液的制备：人肺成纤维细胞复苏后，接种到细胞培养瓶中，置于37℃、5vt％CO2培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至90％的汇合率时，移除培养瓶中的培养基，用磷酸缓冲液洗两次，加入适量0.25％的胰蛋白酶溶液，其中胰蛋白酶/磷酸盐缓冲液的浓度单位为质量：体积；单层孵育约1-2min，用成纤维成纤维细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；
(3)人肺成纤维细胞HPF单细胞悬浮液的细胞浓度的计算：用血球计数板计数法对步骤(2)得到人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，计算出每毫升人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的活细胞数；
(4)人肺成纤维细胞HPF单细胞悬浮液的细胞接种：将步骤(3)计数后的人肺成纤维细胞单细胞悬浮液加入成纤维细胞培养基稀释至2.0×105个/mL，接种到96孔细胞培养板中，接种到60mm细胞培养皿中，每皿4mL，将细胞培养板置于37℃、5vt％CO2培养箱内培养24h；
(5)受试物的分组：将受试物分为两组：细胞对照组和检测样品组；各组的构成为：细胞对照组为成纤维细胞生长培养基上种植人肺成纤维细胞；检测样品组为在成纤维细胞生长培养基上种植人肺成纤维细胞并添加受试物；
(6)受试物检测剂量的设定：将受试物，即电子烟原液分为5非个非零剂量：20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL；
(7)受试物培养品的制备：移除步骤(4)中直径为60mm细胞培养板内的成纤维细胞培养基，再按步骤(5)进行分组，各组的构成为：细胞对照组为成纤维细胞培养基+人肺成纤维细胞；检测样品组为成纤维细胞培养基+人肺成纤维细胞+受试物，并使检测样品组的最终浓度分别为步骤(6)设定的剂量；并且2组培养品用成纤维细胞培养基将每皿液体体积补足至4mL；
(8)受试物的孵育：将步骤(7)加样后的直径为60mm细胞培养皿置于37℃、5vt％CO2培养箱中孵育24h；
(9)受试物孵育品的收集：去除成纤维细胞培养基，用磷酸盐缓冲液PBS洗一遍，加入适量0.25％的胰蛋白酶溶液，其中胰蛋白酶/磷酸盐缓冲液的浓度单位为质量：体积；单层孵育约1-2min，用成纤维细胞培养液悬起，1000rpm低温离心10min；
(10)受试物孵育品的裂解离心：将(9)步骤得到的细胞，加入100μL细胞裂解液，细胞裂解需在冰浴进行，裂解后收集细胞，1600rpm低温离心10min，取上清待后续测定；
(11)标准品稀释：取适量丙二醛用蒸馏水稀释至1、2、5、10、20、50μM，用于制作标准曲线；
(12)受试物样品测定：在不同离心管内加入0.1mL样品待测液、步骤(11)制备的不同浓度梯度的标准品稀释液，随后分别加入0.2mL丙二醛检测工作液，混匀后100℃沸水浴15min，1000rpm室温离心10min，取200μL上清加入96孔板中，酶标仪532nm测定吸光度；
(13)丙二醛含量计算：根据标准溶液吸光度值绘制标准曲线，计算丙二醛含量。
本发明优选的实施方案中，步骤(10)所述的细胞裂解液购买于碧云天公司，是一种在非变性条件下裂解细胞的裂解液。
本发明有益效果：
本发明对样品的有效处理、检测剂量的优化设定以及靶细胞的正确选择，使得本方法能够准确有效的检测卷烟烟气总粒相物对细胞脂质过氧化影响。
具体实施方式
下面将结合具体实例对本发明做详细描述，但并不限制本发明。
本实施例针对1种国内市售卷烟的烟气总粒相物对人肺成纤维细胞脂质过氧化的影响测试。
(1)受试物的前处理：参照中华人民共和国国家标准GB/T 19609-2004《卷烟用常规分析用吸烟机测定总粒相物和焦油》制备卷烟烟气总粒相物样品，样品浓度为10mg/mL；
(2)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的制备：人肺成纤维细胞复苏后，接种到细胞培养瓶中，置于37℃、5vt％CO2培养箱中培养，倒置显微镜观察培养细胞的汇合和形态情况，待细胞长至90％的汇合率时，移除培养瓶中的培养基，用磷酸缓冲液洗两次，加入适量0.25％的胰蛋白酶溶液，其中胰蛋白酶/磷酸盐缓冲液的浓度单位为质量：体积；单层孵育约2min，用成纤维成纤维细胞培养基悬起，形成单细胞悬浮液；
(3)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞浓度的计算：用血球计数板计数法对步骤(2)得到人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞浓度进行计算，计算出每毫升人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的活细胞数；
(4)人肺成纤维细胞单细胞悬浮液的细胞接种：将步骤(3)计数后的人肺成纤维细胞单细胞悬浮液加入成纤维细胞培养基稀释至2.0×105个/mL，接种到96孔细胞培养板中，接种到直径为60mm细胞培养皿中，每皿4mL，将细胞培养板置于37℃、5vt％CO2培养箱内培养24h；
(5)受试物的分组：将受试物分为两组：细胞对照组和检测样品组；各组的构成为：细胞对照组为成纤维细胞生长培养基上种植人肺成纤维细胞；检测样品组为在成纤维细胞生长培养基上种植人肺成纤维细胞并添加受试物；
(6)受试物检测剂量的设定：将受试物，即电子烟原液分为5非个非零剂量：20μg/mL、40μg/mL、60μg/mL、80μg/mL、100μg/mL；
(7)受试物培养品的制备：移除步骤(4)中60mm细胞培养板内的成纤维细胞培养基，再按步骤(5)进行分组，各组的构成为：细胞对照组为成纤维细胞培养基+人肺成纤维细胞；检测样品组为成纤维细胞培养基+人肺成纤维细胞+受试物，并使检测样品组的最终浓度分别为步骤(6)设定的剂量；并且2组培养品用成纤维细胞培养基将每皿液体体积补足至4mL；
(8)受试物的孵育：将步骤(7)加样后的60mm细胞培养皿置于37℃、5vt％CO2培养箱中孵育24h；
(9)受试物孵育品的收集：去除成纤维细胞培养基，用磷酸盐缓冲液PBS洗一遍，加入适量0.25％的胰蛋白酶溶液，其中胰蛋白酶/磷酸盐缓冲液的浓度单位为质量：体积；单层孵育约2min，用成纤维细胞培养液悬起，1000rpm低温离心10min；
(10)受试物孵育品的裂解离心：将(9)步骤得到的细胞，加入100μL细胞裂解液，细胞裂解需在冰浴进行，裂解后收集细胞，1600rpm低温离心10min，取上清待后续测定；
(11)标准品稀释：取适量丙二醛用蒸馏水稀释至1、2、5、10、20、50μM，用于制作标准曲线；
(12)受试物样品测定：在不同离心管内加入0.1mL样品待测液、步骤(11)制备的不同浓度梯度的标准品稀释液，随后分别加入0.2mL丙二醛检测工作液，混匀后100℃沸水浴15min，1000rpm室温离心10min，取200μL上清加入96孔板中，酶标仪532nm测定吸光度；
(13)丙二醛含量计算：根据标准溶液吸光度值绘制标准曲线，计算丙二醛含量。
表1 1种国内市售卷烟的烟气总粒相物对人肺成纤维细胞HPF丙二醛含量变化的影响
由试验结果可以看出，在本发明方法给出的样品处理方法、检测剂量条件下，对照样品组在检测剂量范围内对HPF细胞的丙二醛含量存在影响，且有剂量效应关系，与0剂量组相比存在显著差异(p<0.05)，表明测试体系正常；而样品1#在检测剂量范围内对，与0剂量组相比无显著差异(p>0.05)；以上结果显示，该方法能够有效的检测卷烟烟气粒相物对细胞脂质过氧化的影响。