抗体偶联碳纳米管为敏感材料的生物传感器的制备方法及应用与流程

本发明涉及微纳传感器领域，尤其涉及一种抗体偶联碳纳米管为敏感材料的生物传感器的制备方法及应用。

背景技术：

高灵敏度生物传感器作为一种重要的生化检测手段，在医学诊断、环境监测、食品工业等方面有着广泛的应用。在众多的传感器类别中，基于抗体的生物传感器是其中的一个研究热点，其优点是结构简单、制作容易、灵敏度高、使用灵活多样等。通常传感器的工作模式有动态和静态两种，其中动态模式是通过检测当传感器发生吸附时引起的电流下降来工作的。根据这一工作原理，在生物传感器结构及尺寸一定的情况下，若能增加传感器对被检测抗原的吸附量，则必能使传感器的电流产生更大的下降值，从而提高传感器的输出响应。

作为一类具有高比表面积的新型纳米材料，碳纳米管的敏感性能已经被广泛研究。但是以往的研究都是基于当碳纳米管吸附被检测物质时，其发生一定的物理性能变化这一原理而设计的。而以抗体为检测平台，直接测量碳纳米管吸附目标检测物时电学性能变化的研究并未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术中的缺点和不足，提供一种用抗体偶联碳纳米管作为敏感材料、抗体作为检测平台的生物传感器的制备方法，依据碳纳米管具有高比表面、且特异性吸附某些被检测物的特性，使电流下降这一原理，实现了对某些被检测物的高灵敏度检测。

本发明是通过以下技术方案实现的，抗体偶联碳纳米管为敏感材料的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

S1：多壁碳纳米管的预处理：将多壁碳纳米管加入浓硝酸中超声处理，使所述多壁碳纳米管表面产生大量的羧基位点；

S2：抗体在多壁碳纳米管表面的固定：将经过S1预处理后的多壁碳纳米管与过量的羰基咪唑反应，使多壁碳纳米管表面的羧基形成酰基咪唑；然后加入抗体，使酰基咪唑与抗体反应，将抗体偶联到多壁碳纳米管表面上；

S3：然后加入抗体，使酰基咪唑与抗体反应，将抗体偶联到多壁碳纳米管表面上。得到抗体偶联碳纳米管为敏感材料的生物传感器。

相对于现有技术，通过本发明的抗体偶联碳纳米管为敏感材料的生物传感器的制备方法制备得到的生物传感器，通过吸附被检测物后使所述生物传感器的电流变化，根据电流变化计算出被检测物的量，从而实现高灵敏度检测，可用于pM量级的生物抗原(包括蛋白质、核酸、肿瘤细胞和病毒颗粒等)的检测，并可重复检测。本发明所述的制备方法易于操作、造价低廉，可以批量生产。

进一步，所述S1中，称取多壁碳纳米管加入浓硝酸中超声处理，使多壁碳纳米管表面产生可供修饰的羧基位点；用去离子水稀释上述含多壁碳纳米管的硝酸溶液，然后沉淀12h，移除上层清液，收集沉积的多壁碳纳米管；再用去离子水稀释，用聚四氟乙烯膜抽滤稀释液；经多次抽滤，使滤液的pH值接近7，收集滤膜上的多壁碳纳米管于烘箱内烘干。

进一步，所述S2中，取S1中干燥的多壁碳纳米管，超声分散于N,N'-二甲基甲酰胺中，形成稳定的浓度为0.5mg/mL的悬浮液，将过量的羰基二咪唑加入悬浮液中，羰基二咪唑与多壁碳纳米管侧壁上的羧基位点反应形成酰基咪唑修饰的多壁碳纳米管。

进一步，所述S3中，取5mg酰基咪唑修饰的多壁碳纳米管超声分散于10mL的N,N'-二甲基甲酰胺中，形成稳定的浓度为0.5mg/mL的悬浮液，将抗体浸于悬浮液中，室温反应1h；多壁碳纳米管侧壁上的酰基咪唑与抗体表面的氨基通过酰胺反应，抗体均匀固定于多壁碳纳米管表面上；然后用去离子水冲洗抗体偶联多壁碳纳米管并用氮气吹干，得到抗体偶联碳纳米管为敏感材料的生物传感器。

进一步，所述抗体为针对被检测物的单克隆抗体，所述被检测物为蛋白质、核酸、肿瘤细胞或病毒颗粒。

进一步，所述S1中浓硝酸的质量百分浓度为70％。

进一步，所述S1中的超声时间为1-2h。

本发明还提供了一种所述生物传感器的应用，首先将被检测物用去离子水稀释至pM级浓度，然后滴加于生物传感器的碳纳米管上，再测量碳纳米管的电信号的变化，根据公式计算得出被检测物的浓度，其中ΔC为样品浓度变化，ΔI为电流变化，K为常数；所述被检测物为蛋白质、核酸、肿瘤细胞或病毒颗粒。所述生物传感器为前述任意一种制备方法制备得到的生物传感器。相对于现有技术，本发明的生物传感器利用碳纳米管的高比表面积等特性，通过吸附被检测物后使所述生物传感器的电流变化，根据电流变化计算出被检测物的量，从而实现高灵敏度检测。

为了更好地理解和实施，下面结合附图详细说明本发明。

附图说明

图1是本发明的抗体偶联碳纳米管为敏感材料的生物传感器的制备方法的步骤示意图。

图2是本发明的抗体偶联碳纳米管为敏感材料的生物传感器对蛋白质、核酸、肿瘤细胞、病毒颗粒的检测示意图。

具体实施方式

本发明所述的抗体偶联碳纳米管为敏感材料的生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

S1：多壁碳纳米管的预处理：将多壁碳纳米管(简称)MWCNTs加入浓硝酸中超声处理，使所述多壁碳纳米管表面产生大量的羧基位点。

S2：抗体在多壁碳纳米管表面的固定：将经过S1预处理后的多壁碳纳米管与过量的羰基咪唑反应，使多壁碳纳米管表面的羧基形成酰基咪唑。

S3：然后加入抗体，使酰基咪唑与抗体反应，将抗体偶联到多壁碳纳米管表面上。得到抗体偶联碳纳米管为敏感材料的生物传感器。

其中，所述S1中浓硝酸的质量百分浓度为70％，所述的超声时间为1-2h。

此外，根据被检测物生物抗原的空间构象和生物化学特性，所述生物传感器可以采用分子自组装技术将固定在生物传感器表面的碳纳米管进行进一步的构象调整，可以优化被检测生物抗原与抗体的空间结合，从而提高检测的特异性和敏感性。其中，所述被检测生物抗原包括蛋白质、核酸、肿瘤细胞和病毒颗粒等。

请参阅图1，其是本发明的抗体偶联碳纳米管为敏感材料的生物传感器的制备方法的步骤示意图。所述制备方法包括以下步骤：

S1：称取100mg的多壁碳纳米管，置于125mL的玻璃瓶中，加入质量百分浓度为70％的浓硝酸20mL，超声1-2h，使多壁碳纳米管表面产生可供修饰的羧基位点。用去离子水稀释上述含多壁碳纳米管的硝酸溶液至1000mL，然后沉淀12h，移除上层清液，收集沉积的多壁碳纳米管，再用去离子水稀释，用聚四氟乙烯膜抽滤稀释液；经多次抽滤，使滤液的pH值接近7，收集滤膜上的多壁碳纳米管在105℃烘箱内烘干。

S2：取25mg步骤S1中干燥的多壁碳纳米管，超声分散于50mL N,N'-二甲基甲酰胺中，形成稳定的浓度为0.5mg/mL的悬浮液，将过量的羰基二咪唑加入悬浮液中，羰基二咪唑与多壁碳纳米管侧壁上的羧基位点反应形成酰基咪唑修饰的多壁碳纳米管。前述悬浮液在每次加入羰基二咪唑之前，需要超声10分钟左右，使多壁碳纳米管稳定分散，形成稳定悬浮液。

S3：取5mg酰基咪唑修饰的多壁碳纳米管超声分散于10mL的N,N'-二甲基甲酰胺中，形成稳定的浓度为0.5mg/mL的悬浮液，将抗人TNF-α单克隆抗体浸于悬浮液中，室温反应1h。利用多壁碳纳米管侧壁上的部分酰基咪唑与抗体表面的氨基通过酰胺反应，抗体均匀固定于多壁碳纳米管表面上；然后用去离子水冲洗抗体偶联多壁碳纳米管并用氮气吹干，得到抗体偶联碳纳米管为敏感材料的生物传感器。

请参阅图2，其是本发明的抗体偶联碳纳米管为敏感材料的生物传感器对蛋白质、核酸、肿瘤细胞和病毒颗粒的检测示意图。首先将被检测物用去离子水稀释至pM级浓度，之后将被检测物滴加于生物传感器的传感部件，即抗体偶联的碳纳米管上，由LABVIEW软件测量传感部件(即碳纳米管)在加样前后的电流变化，通过电信号的变化，根据公式(其中，ΔC为样品浓度变化；ΔI为电流变化；K为常数，K因温度、湿度和抗体类型而会有不同的电传导效率，常数K是在对被测物进行检测前，通过定量的标准品进行测试计算得到的)计算得出被检测物的浓度。

相对于现有技术，通过本发明的抗体偶联碳纳米管为敏感材料的生物传感器的制备方法制备得到的生物传感器，通过吸附被检测物后使所述生物传感器的电流变化，根据电流变化计算出被检测物的量，从而实现高灵敏度检测，可用于pM量级生物抗原(包括蛋白质、核酸、肿瘤细胞和病毒颗粒等)的检测，并可重复检测。本发明所述的制备方法易于操作、造价低廉，可以批量生产。

本发明并不局限于上述实施方式，如果对本发明的各种改动或变形不脱离本发明的精神和范围，倘若这些改动和变形属于本发明的权利要求和等同技术范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变形。