一种测定植物过氧化氢酶活性的方法与流程

技术特征：

1.一种测定植物过氧化氢酶活性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、试剂配制，所述试剂配制包括过氧化氢溶液配制、缓冲溶液配制、硫酸溶液的配制和高锰酸钾溶液配制；

S2、植物样品制备，包括采样、清洗、剪碎、研磨、过滤或离心；

S3、标准曲线绘制，包括过氧化氢的标定、标准系列配制、吸光度测定、绘制回归方程；

S4、样品测定，包括吸样、加入试剂、控制反应时间、定容、测定吸光度；

S5、结果计算,包括计算公式、酶活性的表示单位。

2.如权利要求1所属的一种测定植物过氧化氢酶活性的方法，其特征在于，步骤S1试剂配制具体包括以下试剂的配制：

试剂1：缓冲溶液的配制，称取65.52g Na₂HPO₄.12H₂O、2.66g NaH₂PO₄.2H₂O、10g聚乙烯吡咯烷酮，用900mL水溶解，检查调节pH后，定容至1L；

试剂2：过氧化氢溶液配制，吸取30％的过氧化氢溶液1.5mL，用蒸馏水定容至100mL，用高锰酸钾标定其浓度；

试剂3：8％硫酸溶液的配制，吸取40mL浓硫酸缓慢加入400mL水中，冷却后，定容至500mL；

试剂4：高锰酸钾溶液的配制，称取3.16g高锰酸钾，溶解后定容至1L；

试剂5：0.1M草酸钠溶液的配制，称取于105-110℃烘2小时并在干燥器中冷却的草酸钠1.3600g，用试剂3溶解后，并用试剂3定容至100mL。

3.如权利要求1所属的一种测定植物过氧化氢酶活性的方法，其特征在于，步骤S2植物样品的制备具体包括以下步骤：

(1)样品采集：采取特定部位的植物叶片，装入自封袋中，立即带回实验室；

(2)样品清洗：将步骤(1)的植物叶片用自来水洗净叶片上的尘土，再用蒸馏水漂洗3次，用干净的吸水纸吸干叶片表面的水分；

(3)剪碎：将用干净的剪刀将步骤(2)中的叶片剪碎，混匀后称取0.5g放入研钵中；

(4)研磨：加入少量石英砂于研钵中，加入5mL的试剂1，将样品研磨成匀浆，转移于25mL比色管中，用试剂1冲洗研钵3次，每次用试剂1用3mL，并将液体转移于同一比色管中，最后用试剂1定容至刻度，充分摇匀；

(5)离心：将(4)的混合液转移于50mL离心管中，在4000rpm下离心10分钟，将离心液转移于25mL比色管中，保存于4℃冰箱中备用。

4.如权利要求1所属的一种测定植物过氧化氢酶活性的方法，其特征在于，步骤S3标准曲线的绘制具体包括以下步骤：

(1)试剂2的标定：吸取2.5mL试剂2，加入2.5mL试剂3，用试剂4滴定由无色至紫红色，保持半分钟不褪色为终点，记录试剂4的用量；

(2)试剂4的标定：吸取5mL试剂5，用试剂4滴定，接近终点时，加热至65℃，继续滴定至粉红色保持30秒不褪色为终点，记录试剂4的用量，同时做空白试验；

(3)标准系列制备：分别吸取0、1、2、3、4、5mL试剂2依次放于6支50mL的比色管中，各加1mL试剂1和2mL试剂3，用蒸馏水定容至刻度。在240nm波长处，以蒸馏水调节零点，测定各管的吸光度；

(4)回归方程绘制：以吸光度为自变量x，以过氧化氢浓度为因变量y，用Excel绘制散点图，再通过添加趋势线，选择公式和相关系数平方，即可得出回归方程：y＝bx+a。

5.如权利要求1所属的一种测定植物过氧化氢酶活性的方法，其特征在于，步骤S4样品测定具体包括以下步骤：

(1)样品吸取：取2支50mL比色管，管1作为对照，管2作为样品测定。向管1和管2各加S2(5)中的样品待测液1mL；

(2)反应控制：管1加入2mL试剂3，摇匀。管2加入2mL试剂2，摇匀后立即用秒表计时，在恒定的室温下反应10分钟后，立即加入2mL试剂3终止反应；

(3)测定：然后将管1和管2分别用蒸馏水定容至刻度，分别在240nm处测定吸光度，分别记为A₁和A₂。

6.如权利要求1所属的一种测定植物过氧化氢酶活性的方法，其特征在于，步骤S5结果计算：

其中，y表示由吸光度A₁-A₂的值从S3(4)中的回归方程总计算得到的过氧化氢的浓度mg mL^-1；V表示提取待测液的体积mL，Vs表示测定时吸取待测液的体积mL，W表示所称取的植物叶片重量g；t表示反应的时间min；酶活性的表示单位为mg H₂O₂g^-1min^-1，即每克叶片在每分钟内分解的过氧化氢的毫克数。