1.一种测定植物过氧化氢酶活性的方法,其特征在于,包括以下步骤:
S1、试剂配制,所述试剂配制包括过氧化氢溶液配制、缓冲溶液配制、硫酸溶液的配制和高锰酸钾溶液配制;
S2、植物样品制备,包括采样、清洗、剪碎、研磨、过滤或离心;
S3、标准曲线绘制,包括过氧化氢的标定、标准系列配制、吸光度测定、绘制回归方程;
S4、样品测定,包括吸样、加入试剂、控制反应时间、定容、测定吸光度;
S5、结果计算,包括计算公式、酶活性的表示单位。
2.如权利要求1所属的一种测定植物过氧化氢酶活性的方法,其特征在于,步骤S1试剂配制具体包括以下试剂的配制:
试剂1:缓冲溶液的配制,称取65.52g Na2HPO4.12H2O、2.66g NaH2PO4.2H2O、10g聚乙烯吡咯烷酮,用900mL水溶解,检查调节pH后,定容至1L;
试剂2:过氧化氢溶液配制,吸取30%的过氧化氢溶液1.5mL,用蒸馏水定容至100mL,用高锰酸钾标定其浓度;
试剂3:8%硫酸溶液的配制,吸取40mL浓硫酸缓慢加入400mL水中,冷却后,定容至500mL;
试剂4:高锰酸钾溶液的配制,称取3.16g高锰酸钾,溶解后定容至1L;
试剂5:0.1M草酸钠溶液的配制,称取于105-110℃烘2小时并在干燥器中冷却的草酸钠1.3600g,用试剂3溶解后,并用试剂3定容至100mL。
3.如权利要求1所属的一种测定植物过氧化氢酶活性的方法,其特征在于,步骤S2植物样品的制备具体包括以下步骤:
(1)样品采集:采取特定部位的植物叶片,装入自封袋中,立即带回实验室;
(2)样品清洗:将步骤(1)的植物叶片用自来水洗净叶片上的尘土,再用蒸馏水漂洗3次,用干净的吸水纸吸干叶片表面的水分;
(3)剪碎:将用干净的剪刀将步骤(2)中的叶片剪碎,混匀后称取0.5g放入研钵中;
(4)研磨:加入少量石英砂于研钵中,加入5mL的试剂1,将样品研磨成匀浆,转移于25mL比色管中,用试剂1冲洗研钵3次,每次用试剂1用3mL,并将液体转移于同一比色管中,最后用试剂1定容至刻度,充分摇匀;
(5)离心:将(4)的混合液转移于50mL离心管中,在4000rpm下离心10分钟,将离心液转移于25mL比色管中,保存于4℃冰箱中备用。
4.如权利要求1所属的一种测定植物过氧化氢酶活性的方法,其特征在于,步骤S3标准曲线的绘制具体包括以下步骤:
(1)试剂2的标定:吸取2.5mL试剂2,加入2.5mL试剂3,用试剂4滴定由无色至紫红色,保持半分钟不褪色为终点,记录试剂4的用量;
(2)试剂4的标定:吸取5mL试剂5,用试剂4滴定,接近终点时,加热至65℃,继续滴定至粉红色保持30秒不褪色为终点,记录试剂4的用量,同时做空白试验;
(3)标准系列制备:分别吸取0、1、2、3、4、5mL试剂2依次放于6支50mL的比色管中,各加1mL试剂1和2mL试剂3,用蒸馏水定容至刻度。在240nm波长处,以蒸馏水调节零点,测定各管的吸光度;
(4)回归方程绘制:以吸光度为自变量x,以过氧化氢浓度为因变量y,用Excel绘制散点图,再通过添加趋势线,选择公式和相关系数平方,即可得出回归方程:y=bx+a。
5.如权利要求1所属的一种测定植物过氧化氢酶活性的方法,其特征在于,步骤S4样品测定具体包括以下步骤:
(1)样品吸取:取2支50mL比色管,管1作为对照,管2作为样品测定。向管1和管2各加S2(5)中的样品待测液1mL;
(2)反应控制:管1加入2mL试剂3,摇匀。管2加入2mL试剂2,摇匀后立即用秒表计时,在恒定的室温下反应10分钟后,立即加入2mL试剂3终止反应;
(3)测定:然后将管1和管2分别用蒸馏水定容至刻度,分别在240nm处测定吸光度,分别记为A1和A2。
6.如权利要求1所属的一种测定植物过氧化氢酶活性的方法,其特征在于,步骤S5结果计算:
其中,y表示由吸光度A1-A2的值从S3(4)中的回归方程总计算得到的过氧化氢的浓度mg mL-1;V表示提取待测液的体积mL,Vs表示测定时吸取待测液的体积mL,W表示所称取的植物叶片重量g;t表示反应的时间min;酶活性的表示单位为mg H2O2g-1min-1,即每克叶片在每分钟内分解的过氧化氢的毫克数。