一种以银纳米线为基底的荧光纳米温度计及其制备方法与流程
本发明涉及纳米温度计领域。更具体地，涉及一种以银纳米线为基底的荧光纳米温度计及其制备方法。
背景技术：
温度作为一个重要的参数，对很多化学反应和生物过程具有调控作用。准确测量微小体系的温度，对调控微化学反应和从细胞水平认知生命过程具有重要意义。常用的温度计(如热耦温度计)由于空间分辨率低等问题，使其不能满足微小体系(如细胞内特定区域)内温度的测定。随着纳米材料制备方法的完善和纳米技术的不断发展，纳米温度计已被广泛研究(Qi,Li.Surface-Modified Silicon Nanoparticles with Ultrabright Photoluminescence and Single-Exponential Decay for Nanoscale Fluorescence Lifetime Imaging of Temperature.Journal of the American Chemical Society,2013,135:10372-14927)。这些纳米温度计大都是以纳米颗粒为基底对温度进行测量，纳米颗粒在进入微小体系如细胞时通过被动扩散，或者需要靶向性修饰进入细胞特定部位。一维纳米材料由于可以借助微操作插入特定微小体系(如细胞特定部位)(Junho,Lee.Quantitative Probing of Cu2+Ions Naturally Present in Single Living Cells.Advanced Materials,2016,(28):4071-4076)实现对微小体系的主动检测，使其在微小体系温度计研究中有明显优势。
因此，发展基于一维纳米材料的温度计对微小体系温度的准确检测具有重要意义。
技术实现要素：
本发明的一个目的在于提供一种以银纳米线为基底的荧光纳米温度计，可用于微小体系温度的检测。
本发明的另一个目的在于提供一种上述荧光纳米温度计的制备方法。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种以银纳米线为基底的荧光纳米温度计，所述荧光纳米温度计以银纳米线为基底，银纳米线表面组装带有荧光分子的特定DNA片段和辅助链T的一维纳米温度计。
进一步，所述特定DNA片段的序列为3’端修饰有-(CH2)3-SH的ATCTAATCATTATTGTTTTTTTTTTTTTTTACTATTATGTTTAGATTTTTTTTTTT(如SEQ ID No.1所示)(即ATCTAATCATTATTGTTTTTTTTTTTTTTTACTATTATGTTTAGATTTTTTTTTTT-(CH2)3-SH)。
进一步，所述荧光分子为5’TEXAs-red。
进一步，所述的辅助链T的序列为3’端修饰有-(CH2)3-SH的TTTTTTTTTT(如SEQ ID No.2所示)(即TTTTTTTTTT-(CH2)3-SH)。
进一步，所述银纳米线的直径为100-200nm，长度为50-100μm。
一种以银纳米线为基底的荧光纳米温度计的制备方法，包括以下步骤：
(1)利用多元醇法制备银纳米线
a、配制0.1M AgNO3的溶液，0.15M PVP溶液，0.3mM FeCl3溶液，以上溶剂均为乙二醇；
b、将1ml 0.3mM FeCl3溶液加入到9ml 0.15M PVP溶液中，混合均匀后滴加入剧烈搅拌的10ml 0.1M AgNO3的溶液中；待反应浑浊后停止搅拌(约4h)转入高压釜中保持160℃3小时；将产物取出，分别用丙酮、乙醇和水洗涤，得银纳米线；
(2)将带有荧光分子的特定DNA片段(20μL，100μM)和辅助链T(10μL，100μM)与还原剂(30μL，100μM)混合孵育1-1.5小时，进行还原反应，以打开DNA序列中的二硫键；将还原好的特定DNA片段和辅助链T与2-3mg/ml的银纳米线混合，使得还原好的特定DNA片段和辅助链T的浓度分别为2μM和1μM，震荡孵育10-12小时后加入1-2M NaCl溶液，使体系达到0.1M NaCl，并继续孵育10-12小时；得到的产物用缓冲液洗涤三次，即得。
进一步，将以银纳米线为基底的荧光纳米温度计分散在测试缓冲液(0.1M NaCl,10mM PB,pH＝7.4)中，在荧光光谱仪上进行测试，激发波长为585nm，发射波长为612nm。
进一步，所述还原剂为pH＝5.2的三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐的醋酸缓冲液。
进一步，所述缓冲液为0.1M NaCl,10mM PB,pH＝7.4。
本发明以银纳米线为基底的荧光纳米温度计利用一定温度下，DNA序列解链改变发光分子与银纳米线之间的距离，调控银纳米线与荧光分子之间的能量转移，利用荧光强度的变化实现银纳米线对温度的检测。
本发明的有益效果如下：
1、本发明银纳米线具有制备简单、容易表面功能化、对荧光分子具有很好的猝灭效应的特点，使其在作为一维纳米材料温度计的基底中有很好的前景。
2、本发明以银纳米线为基底，通过对温度有响应的特定DNA片段将荧光分子组装在银纳米线表面，构建了基于银纳米线的荧光温度计，该温度计可用于微小体系温度的检测，进一步发展有望用于细胞特定部位温度的检测。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1示出基于银纳米线的荧光纳米温度计的结构以及工作原理示意图；
图2示出银纳米线的扫描电镜图；
图3示出基于银纳米线的荧光纳米温度计荧光强度随温度的变化，温度变化范围为20℃-50℃；
图4示出基于银纳米线的荧光纳米温度计荧光强度随温度的变化，温度变化范围为30℃-35℃，间隔为0.5℃；
图5示出基于银纳米线的荧光纳米温度计荧光强度随温度循环的变化，温度变化为20℃到50℃；
图6示出荧光分子-DNA片段在没有银纳米线存在时同样条件下荧光强度随温度的变化，温度变化范围为20℃-50℃。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实施例1以银纳米线为基底的荧光纳米温度计的制备方法
(1)利用多元醇法制备银纳米线
a、配制10ml 0.1M AgNO3的溶液，9ml 0.15M PVP溶液，1ml 0.3mM FeCl3溶液，以上溶剂均为乙二醇；
b、将1ml 0.3mM FeCl3溶液加入到9ml 0.15M PVP溶液中，混合均匀后滴加入剧烈搅拌的10ml 0.1M AgNO3的溶液中；待反应浑浊后停止搅拌(约4h)转入高压釜中保持160℃3小时；将产品取出，分别用丙酮、乙醇和水洗涤，洗涤干净之后保存在酒精中。制备得到的银纳米线的扫描电子显微镜照片如图2所示。
(2)将带有荧光分子(5’TEXAs-red)的特定DNA片段(即ATCTAATCATTATTGTTTTTTTTTTTTTTTACTATTATGTTTAGATTTTTTTTTTT-(CH2)3-SH)(20μL，100μM)和辅助链T(即TTTTTTTTTT-(CH2)3-SH)(10μL，100μM)与三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐的醋酸缓冲液(PH＝5.2)(30μL，100μM)混合孵育1小时，进行还原反应，以打开DNA序列中的二硫键；将还原好的特定DNA片段和辅助链T与3mg/ml的银纳米线混合，使得特定DNA片段和辅助链T的浓度分别为2μM和1μM，震荡孵育12小时后，加入适量的1M NaCl溶液，使体系达到0.1M NaCl，并继续孵育12小时；所得产物用缓冲液(0.1M NaCl,10mM PB,pH＝7.4)洗涤三次，即得以银纳米线为基底的荧光纳米温度计。以银纳米线为基底的荧光纳米温度计的原理为：利用一定温度下，DNA序列解链改变发光分子与银纳米线之间的距离，调控银纳米线与荧光分子之间的能量转移，利用荧光强度的变化实现银纳米线对温度的检测(如图1所示)。
(3)将步骤(2)所得的以银纳米线为基底的荧光纳米温度计分散在测试缓冲液(0.1M NaCl,10mM PB,pH＝7.4)中，在荧光光谱仪上进行测试，激发波长为585nm，发射波长为612nm。测试范围为20-50℃，温度间隔为5℃，结果如图3所示，从图中可以看出：从20度升温到50度，再从50度降温到20度，升温和降温得到的相对荧光强度变化趋势一致，说明以银纳米线为基底的荧光纳米温度计有很好的可逆性。
实施例2以银纳米线为基底的荧光纳米温度计的制备方法
(1)利用多元醇法制备银纳米线。
a、配制10ml 0.1M AgNO3的溶液，9ml 0.15M PVP溶液，1ml 0.3mM FeCl3溶液，以上溶剂均为乙二醇；
b、将1ml 0.3mM FeCl3溶液加入到9ml 0.15M PVP溶液中，混合均匀后滴加入剧烈搅拌的10ml 0.1M AgNO3的溶液中；待反应浑浊后停止搅拌(约4h)转入高压釜中保持160℃3小时；将产品取出，分别用丙酮、乙醇和水洗涤，洗涤干净之后保存在酒精中；
(2)将带有荧光分子(5’TEXAs-red)的特定DNA片段(即ATCTAATCATTATTGTTTTTTTTTTTTTTTACTATTATGTTTAGATTTTTTTTTTT-(CH2)3-SH)(20μL，100μM)和辅助链T(即TTTTTTTTTT-(CH2)3-SH)(10μL，100μM)与三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐的醋酸缓冲液(PH＝5.2)(30μL，100μM)混合孵育1.5小时，进行还原反应，以打开DNA序列中的二硫键；将还原好的特定DNA片段和辅助链T与2mg/ml的银纳米线混合，使得特定DNA片段和辅助链T的浓度分别为2μM和1μM，震荡孵育10小时后，加入适量的2M NaCl溶液，使体系达到0.1M NaCl，并继续孵育11小时；所得产物用缓冲液(0.1M NaCl,10mM PB,pH＝7.4)洗涤三次，即得到以银纳米线为基底的荧光纳米温度计。
(3)将步骤(2)所得的以银纳米线为基底的荧光纳米温度计分散在测试缓冲液(0.1M NaCl,10mM PB,pH＝7.4)中，在荧光光谱仪上进行测试，激发波长为585nm，发射波长为612nm。测试范围为30-35℃，温度间隔为0.5℃，结果如图4所示，从图中可以看出：以银纳米线为基底的荧光纳米温度计在该温度范围内相对荧光强度与温度呈很好的线性响应。
实施例3以银纳米线为基底的荧光纳米温度计的制备方法
(1)利用多元醇法制备银纳米线。
a、配制10ml 0.1M AgNO3的溶液，9ml 0.15M PVP溶液，1ml 0.3mM FeCl3溶液，以上溶剂均为乙二醇；
b、将1ml 0.3mM FeCl3溶液加入到9ml 0.15M PVP溶液中，混合均匀后滴加入剧烈搅拌的10ml 0.1M AgNO3的溶液中；待反应浑浊后停止搅拌(约4h)转入高压釜中保持160℃3小时；将产品取出，分别用丙酮、乙醇和水洗涤，洗涤干净之后保存在酒精中；
(2)将带有荧光分子(5’TEXAs-red)的特定DNA片段(即ATCTAATCATTATTGTTTTTTTTTTTTTTTACTATTATGTTTAGATTTTTTTTTTT-(CH2)3-SH)(20μL，100μM)和辅助链T(即TTTTTTTTTT-(CH2)3-SH)(10μL，100μM)与三(2-甲酰乙基)膦盐酸盐的醋酸缓冲液(PH＝5.2)(30μL，100μM)混合孵育1.2小时，进行还原反应，以打开DNA序列中的二硫键；将还原好的特定DNA片段和辅助链T与2.5mg/ml的银纳米线混合，使得特定DNA片段和辅助链T的浓度分别为2μM和1μM，震荡孵育11小时后，加入适量的2M NaCl溶液，使体系达到0.1M NaCl，并继续孵育10小时；所得产物用缓冲液(0.1M NaCl,10mM PB,pH＝7.4)洗涤三次，即得到以银纳米线为基底的荧光纳米温度计。
(3)将步骤(2)所得的以银纳米线为基底的荧光纳米温度计分散在测试缓冲液(0.1M NaCl,10mM PB,pH＝7.4)中，在荧光光谱仪上进行测试，激发波长为585nm，发射波长为612nm。测试范围为20-50℃，循环多次，结果如图5所示。同时，测试了没有银纳米线时DNA序列的荧光随温度的变化，结果如图6所示。结果表明：以银纳米线为基底的荧光纳米温度计有很好的重复性，其荧光随温度变化主要来自于银纳米线与DNA序列的作用，温度升高抑制了银纳米线与TEXAs-red之间的能量转移，使荧光增强。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院理化技术研究所
<120> 一种以银纳米线为基底的荧光纳米温度计及其制备方法
<130> JLC16I0735E
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工合成的特定DNA片段
<400> 1
atctaatcat tattgttttt tttttttttt actattatgt ttagattttt tttttt 56
<210> 2
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工合成的辅助链T
<400> 2
tttttttttt 10
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