本发明涉及免疫层析技术，具体地说，是涉及同时对食品中两种真菌毒素同时进行检测的以胶体金标记真菌毒素特异性单克隆抗体和肉眼判定为基础的二联定性免疫层析试纸条的制备方法。
背景技术：
现阶段时常爆发的食品安全中毒事件，除了某些由无机化合物如氰化钾、砒霜引起外，绝大部分都是来自生物毒素，微生物毒素最为常见，食物中毒绝大部分是细菌毒素或真菌毒素引起的。其中，真菌毒素(Mycotoxin)是一类由真菌产生的小分子次级代谢产物，农作物在生长、收获、贮存和运输等环节均易受到真菌毒素污染，现已发现400多种真菌毒素，大部分具有致癌、致畸和致突变作用，并且混合污染时，毒性会显著增强。
真菌毒素可通过污染谷物和饲料或经动物源性食品进入食物链，对人类和动物健康造成严重伤害，近年来已成为食品安全领域的研究重点。真菌毒素现有检测方法包括生物鉴定法、化学分析法、仪器分析法和免疫分析法等。生物鉴定法专一性不强；化学分析法精确度低；仪器分析灵敏度高，可准确进行定量，但样本前处理复杂且检测仪器昂贵，难以在基层实验室推广使用，免疫层析试纸条可用于现场的快速检测，并且不需要其他辅助仪器，可弥补其他检测方法复杂而耗时的缺点，成本较低，近年来在真菌毒素检测领域发展迅速。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中酶标免疫技术耗时长和常规胶体金免疫层析试纸条单通道检测以及结果判定方式复杂等缺点，提供一种真菌毒素二联胶体金免疫层析试纸条及制备方法。
为解决技术问题，本发明的解决方案是：
提供一种二联定性真菌毒素胶体金免疫层析试纸条，包括作为基材的黑色长条状聚氯乙烯背板；在沿背板长度方向在其表面依次布置样品垫、胶体金抗体标记物固定垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，相邻垫或膜间彼此搭接；在硝酸纤维素膜上，设有与背板同宽的彼此间隔的两条检测线和一条质控线，其中质控线位于两条检测线之间；
在胶体金抗体标记物固定垫上，以喷涂、敷涂或浸泡的方式固定有真菌毒素单克隆抗体、兔多克隆抗体的胶体金标记复合物；所述质控线是将山羊抗兔多克隆抗体喷涂于硝酸纤维素膜上形成，所述检测线是将待检真菌毒素偶联抗原喷涂于硝酸纤维素膜上形成，两条检测线所含真菌毒素偶联抗原是不同的。
本发明中，所述真菌毒素单克隆抗体所对应的真菌毒素，是赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮、黄曲霉毒素B1或呕吐毒素中的任意一种。
本发明中，该试纸条的宽度为0.4cm，样品垫、胶体金抗体标记物固定垫、硝酸纤维素膜和吸收垫的长度分别为1.7cm、0.8cm、2.5cm、1.7cm；其中，样品垫与胶体金抗体标记物固定垫的搭接重合长度为0.2cm，胶体金抗体标记物固定垫与硝酸纤维素膜的搭接重合长度为0.2cm，硝酸纤维素膜与吸收垫的搭接重合长度为0.3cm；在硝酸纤维素膜上，两条检测线及第二检测线与质控线之间的间距分别为0.4cm、0.4cm，并且质控线位于两条检测线之间。
本发明中，所述胶体金抗体标记物固定垫上的胶体金标记复合物的制备方法如下：
使用0.2M K2CO3调节胶体金溶液pH，取50mL边搅拌边迅速加入10mM Tris-HCl溶液(pH7.4)稀释的待标记抗体50μg，室温混匀作用30min后加入BSA蛋白溶液封闭，终浓度为1％，充分混匀作用30min后，2000×g 4℃离心20min，弃沉淀；上清以8000×g 4℃离心30min后弃上清；使用10mL 2mM并含有1％BSA的硼酸盐缓冲液(pH7.4)重悬后，以8000×g离心20min，洗涤未结合抗体；重复洗涤两次，弃上清，沉淀用5mL硼酸盐缓冲液重悬后分装，置于4℃保存备用；采用免疫层析法对制备的金标抗体进行鉴定，即将真菌毒素偶联抗原、羊抗鼠和羊抗兔二抗分别划线于NC膜上，组装成简易的层析系统，将制备的金标抗体点在样品垫上，观察是否形成红色条带，判断是否标记成功且有无抗体活性。
本发明进一步提供了制备前所述试纸条的方法，包括下述步骤：
(1)制备胶体金抗体标记物固定垫
按照上述方法制备得到真菌毒素特异性单克隆抗体、兔多克隆抗体-胶体金标记复合物，4℃放置，备用；
以喷涂、敷涂或浸泡的方式，将抗体-胶体金标记物固定在胶体金抗体标记物固定垫上，在37℃干燥2小时备用；
(2)取硝酸纤维素膜贴于作为基材的长条状聚氯乙烯背板上，点膜仪在硝酸纤维素膜上同时喷涂两条检测线和一条质控线，其中质控线位于两条检测线之间；质控线的喷涂液为山羊抗兔多克隆抗体，两条检测线的喷涂液是不同种类的待检真菌毒素偶联抗原；在37℃干燥2小时后，置于聚乙二醇溶液中浸泡30分钟，晾干后在37℃干燥2小时备用；
(3)将样品垫、胶体金抗体标记物固定垫和吸收垫布置于聚氯乙烯背板上，并使样品垫、胶体金抗体标记物固定垫、硝酸纤维素膜和吸收垫依次排列，硝酸纤维素膜的质控线位于两条检测线之间，且相邻垫或膜间彼此搭接；
(4)将聚氯乙烯背板及其贴附的材料切成4mm宽的层析条，将层析条放入塑料板卡内，用压卡机压实。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明以采用成本较低的胶体金作为抗体标记物，采用竞争法原理对真菌毒素进行快速检测，硝酸纤维素膜同时包被两条检测线，分别为待检真菌毒素偶联抗原，包被的检测线为山羊抗兔抗体，位于两条检测线之间，通过肉眼比较显色的深浅，可同时对两种真菌毒素进行快速定性检测。所制备的层析试纸条具有良好的灵敏度和稳定性且操作简便快捷，成本低，特别适用于现场的快速诊断。
附图说明
图1为本发明中二联定性胶体金免疫层析试纸条的结构示意图。
图中附图标记：1、样品垫；2、胶体金抗体标记物固定垫；3、硝酸纤维素膜；4、吸收垫；5、第一检测线；6、质控线；7、第二检测线。
具体实施方式
发明原理描述：
本发明中采用制备简单、成本较低的胶体金对抗体进行标记，采用竞争法原理同时对食品中两种真菌毒素进行快速定性检测。
可同时检测两种真菌毒素的二联胶体金免疫层析试纸条，包括作为基材的黑色长条状聚氯乙烯背板，沿背板长度方向在其表面依次布置有样品垫1、胶体金抗体标记物固定垫2、硝酸纤维素膜3和吸收垫4，相邻垫或膜间彼此搭接；硝酸纤维素膜3上设有与背板同宽的且彼此相间隔的检测线5、质控线6和检测线7，其中质控线7位于两条检测线5、6之间；在胶体金抗体标记物固定垫2上，以喷涂、敷涂或浸泡的方式固定有真菌毒素特异性单克隆和兔多克隆抗体胶体金标记复合物；质控线6是将山羊抗兔多克隆抗体喷涂于硝酸纤维素膜3上形成，第一检测线5和第二检测线7是将待检的真菌毒素偶联抗原喷涂于硝酸纤维素膜3形成，第一检测线5和第二检测线7所含真菌毒素偶联抗原是不同的。
该试纸条的宽度为0.4cm，样品垫1、胶体金抗体标记物固定垫2、硝酸纤维素膜3和吸收垫4的长度分别为1.7cm、0.8cm、2.5cm、1.7cm；
样品垫1与胶体金抗体标记物固定垫2的搭接重合长度为0.2cm，胶体金抗体标记物固定垫2与硝酸纤维素膜3的搭接重合长度为0.2cm，硝酸纤维素膜3与吸收垫4的搭接重合长度为0.3cm；在硝酸纤维素膜3上，第一检测线5、第二检测线7和质控线6的间距分别为0.4cm、0.4cm。
所述真菌毒素单克隆抗体所对应的真菌毒素，是赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯、黄曲霉毒素B1和呕吐毒素中的任意一种。
本发明胶体金抗体标记物固定垫上的胶体金标记复合物的制备采用下述方法：
使用0.2M K2CO3调节胶体金溶液pH，取50mL边搅拌边迅速加入10mM Tris-HCl溶液(pH7.4)稀释的待标记抗体50μg，室温混匀作用30min后加入BSA蛋白溶液封闭，终浓度为1％，充分混匀作用30min后，2000×g 4℃离心20min，弃沉淀；上清以8000×g 4℃离心30min后弃上清；使用10mL 2mM并含有1％BSA的硼酸盐缓冲液(pH7.4)重悬后，以8000×g离心20min，洗涤未结合抗体；重复洗涤两次，弃上清，沉淀用5mL硼酸盐缓冲液重悬后分装，置于4℃保存备用；采用免疫层析法对制备的金标抗体进行鉴定，即将真菌毒素偶联抗原、羊抗鼠和羊抗兔二抗分别划线于NC膜上，组装成简易的层析系统，将制备的金标抗体点在样品垫上，观察是否形成红色条带，判断是否标记成功且有无抗体活性。
二联胶体金定性免疫层析试纸条的制备方法，包括下述步骤：
1、制备胶体金抗体标记物固定垫
按照上述方法得到真菌毒素特异性单克隆和兔多克隆抗体胶体金标记复合物，4℃放置，备用；
以喷涂、敷涂或浸泡的方式，将真菌毒素特异性单克隆和兔多克隆抗体胶体金标记复合物固定在抗体标记物固定垫2上，在37℃干燥2小时备用；
2、检测线与质控线的喷涂：取硝酸纤维素膜3贴于作为基材的长条状聚氯乙烯背板上，点膜仪在硝酸纤维素膜3同时上喷涂第一检测线5、质控线6、第二检测线7，其中质控线6位于两条检测线之间；质控线6的喷涂液的为山羊抗兔多克隆抗体，第一检测线5和第二检测线7的喷涂液是不同种类的待检真菌毒素偶联抗原；在37℃干燥2小时后，置于聚乙二醇溶液中浸泡30分钟，晾干后在37℃干燥2小时备用；
3、免疫层析试纸条的组装：将样品垫1、胶体金抗体标记物固定垫2和吸收垫4布置于聚氯乙烯背板上，并使样品垫1、胶体金抗体标记物固定垫2、硝酸纤维素膜3和吸收垫4依次排列，质控线6位于两条检测线之间，且相邻垫或膜间彼此搭接；将聚氯乙烯背板及其贴附材料切成4mm宽层析条，将层析条放入塑料板卡内，用压卡机压实。
实施例1：赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮二联定性胶体金免疫层析试纸条的制备
具体制备过程如下：
1、制备胶体金-赭曲霉毒素A单克隆抗体标记物、胶体金-玉米赤霉烯酮单克隆抗体和胶体金-兔多克隆抗体标记物固定垫
常规法制备并纯化抗赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮鼠单克隆抗体，浓度分别为5mg/mL和3mg/mL，购买商品化兔多克隆抗体，浓度为10mg/mL，备用；
制备抗体胶体金标记复合物：使用0.2M K2CO3调节胶体金溶液pH，取50mL边搅拌边迅速加入10mM Tris-HCl溶液(pH7.4)稀释的待标记赭曲霉毒素A单克隆抗体50μg室温混匀作用30min；加入BSA蛋白溶液，终浓度为1％，充分混匀作用30min后，2000×g 4℃离心20min，弃沉淀；上清以8000×g 4℃离心30min后弃上清；使用10mL 2mM并含有1％BSA的硼酸盐缓冲液(pH 7.4)重悬后以8000×g离心20min洗涤未结合抗体；重复洗涤两次，弃上清，沉淀用5mL硼酸盐缓冲液重悬后分装，置于4℃保存备用；
采用免疫层析法对制备的金标抗体进行鉴定，即将真菌毒素偶联抗原、羊抗小鼠二抗或羊抗兔分别划线于NC膜上，组装成简易的层析系统，将制备的金标抗体点在样品垫上，观察是否形成红色条带，判断是否标记成功且有无抗体活性。按照相同的方法得到玉米赤霉烯酮单克隆抗体和兔多克隆抗体胶体金标记复合物；
设定点膜仪的喷涂参数为30.0μL/cm，将三种胶体金-抗体复合物混匀后连接在点膜仪的C管道接口。取规格为30cm×1cm的胶体金抗体标记物固定垫2放置于点膜仪的运动平台上。开启点膜仪，在胶体金抗体标记物固定垫2上喷涂抗体胶体金复合物，37℃干燥2小时。
2、胶体金免疫层析试纸条检测线与质控线的喷涂：取硝酸纤维素膜3贴于低背景值PVC背板，设定点膜仪的喷涂参数为2μl/cm。取5mg/ml的赭曲霉毒素A偶联抗原OTA-OVA 1.5mL和2mg/mL的玉米赤霉烯酮偶联抗原ZEN-OVA 1.5ml，分别接到点膜仪的A、C管道接口处，并同时取4mg/mL的山羊抗兔多克隆抗体接到点膜仪的B管道接口，其中A，B，C的管道口间距均为0.4cm，将贴有硝酸纤维素膜3的PVC背板置于点膜仪的往复运动平台上。开启点膜仪，在硝酸纤维素膜3上分别喷涂真菌毒素偶联抗原和山羊抗兔抗体，37℃干燥2小时。将背板置于聚乙二醇溶液中浸泡30分钟后晾干后37℃干燥2小时。
3、免疫层析试纸条的组装：在固定于PVC板上的硝酸纤维素膜3靠近山羊抗鼠抗体端贴上吸收垫4，硝酸纤维素膜3与吸收垫4在长度上重合0.3cm，在靠近真菌毒素偶联抗原端依次贴上胶体金抗体标记物固定垫2和样品垫1，胶体金抗体标记物固定垫2与硝酸纤维素膜3在长度上重合0.2cm，样品垫1与胶体金抗体标记物固定垫2长度方向上重合0.2cm，最后将PVC背板及其贴附的材料切成4mm宽层析条，将层析条放入塑料板卡内，用压卡机压实。
当加入被检测样品时，位于胶体金抗体标记物固定垫2上的胶体金抗体复合物通过层析作用与样品混匀后向吸收垫一端移动，当样品中的两种待检真菌毒素超标时可与抗体-胶体金标记复合物完全结合，使得没有多余的胶体金-真菌毒素单克隆抗体复合物与第一检测线5和第二检测线7上的偶联抗原进行结合，此时第一检测线5和第二检测线7不显色，呈阳性反应，表明待检物质超标，如果有颜色但相比质控线，颜色深浅差异明显，同样被判定被检测样品呈阳性，此时可获得更高的检测灵敏度。无论待检样品中是否含有两种待检物质含，兔多克隆抗体胶体金复合物都会经层析作用移动到质控线6处，与该处的山羊抗兔抗体结合，提示该检测系统有效且在样本呈阴性情况下，与两条质控线颜色眼观无明显区别；如果该处没有显色，表明检测系统失效，检测结果无效。
应用赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮二联定性胶体金免疫层析试纸条对采集的60份食物样本进行了检测，并与ELISA进口试剂盒检测结果进行了对比(赭曲霉毒素A：货号R1311，黄曲霉毒素B1：货号R1211；均购于德国拜发)。定性检测时(赭曲霉毒素A含量≥5μg/kg，玉米赤霉烯酮含量≥10μg/kg)，赭曲霉毒素A阳性样本为6个，黄玉米赤霉烯酮阳性样本为12个，与试剂盒的符合率达到100％，表明可用于食品中赭曲霉毒素A与玉米赤霉烯酮的快速定性检测。
以上是结合具体实施例子对本发明所做的进一步描述。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明原理的前提下，本发明及其应用还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
特别说明：
虽然本发明的实施例中只列举了竞争原理同时对两种真菌毒素进行定性检测。在本发明提供所述基于胶体金标记抗体的免疫层析技术，同时对两种真菌毒素进行快速定性检测后，本领域技术人员能够根据其掌握的技能举一反三，实现检测其他目标物质的目的。