一种蓝莓中花青苷类物质的检测分析方法与流程

本发明属于检测分析技术领域，具体涉及一种蓝莓中花青苷类物质的检测分析方法。

背景技术：

蓝莓(Blueberry)属杜鹃花科(Ericaceae)越桔属(Vaccinium)植物，是一种新兴果树，富含花青素、熊果酸、黄酮等抗氧化物质，具有改善视力、增强记忆力、软化血管、抗癌等多种功能，倍受消费者的青睐，具有广阔的发展前景。蓝莓果实的抗氧化活性主要决定于其含有丰富的花青苷类物质。因此，蓝莓中花青苷的含量是决定其品质的重要因素之一。

花青苷是一种广泛存在于植物体中的水溶性天然色素，属黄酮类化合物，在植物体内主要呈现蓝色、紫色和红色。目前国内外关于花青苷的研究主要集中在分离、鉴定、生物合成机理和保健功能研究等方面。关于花青苷的检测方法，目前常用紫外可见分光光度法、液相色谱法和液相色谱串联质谱法。其中，高效液相色谱串联质谱法相比较其它方法在快速分离、准确定性和灵敏度等方面更具有优势。党娅等人（中国调味品，第40卷第5期：76-81）公开了一种蓝莓花青苷提取及组分分析研究，采用超高效液相色谱-三重四级杆串联质谱法对蓝莓中花青苷进行分析，但仅检测到四种组分，优势不明显。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种蓝莓中花青苷类物质的检测分析方法，本发明以蓝莓成熟果实为研究对象，建立起UPLC-MS/MS测定方法，利用多重反应监测模式对蓝莓果实中花青苷组分进行定性和定量分析，旨在为蓝莓的品质评价和优异种质挖掘提供科学依据。

本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：

本发明提供了一种蓝莓中花青苷类物质的检测分析方法，包括以下步骤：

（1）取1-2mm厚蓝莓成熟果实的果皮0.5g，加液氮研磨后，置于离心管中，加入甲醇-0.15%甲酸水-环己六醇15mL，超声波震荡10min后，首先置于-15℃下保存10min，取出恢复至室温后，再置于4℃下浸提24h，离心，收集上清液；

（2）将上清液通过装入玻璃层析柱的活化完全的大孔树脂进行净化洗脱，收集洗脱液，蒸发至浸膏状，用甲醇-0.1%甲酸水溶液复溶并定容至2mL，过滤，得滤液；

（3）将滤液采用超高效液相色谱-质谱法进行分析检测。

进一步的，步骤（1）中，所述甲醇-0.15%甲酸水-环己六醇的体积比为2:8:5。

进一步的，所述大孔树脂为HPD-45A。

上述大孔树脂采用的活化方法为：首先将大孔树脂在质量浓度为15%的氯化钠溶液中浸泡5min，然后置于质量浓度为8%的氯化钠溶液中浸泡2min，蒸馏水冲洗，再用体积分数为95%乙醇浸泡24h，用蒸馏水洗至无味，再用5%氢氧化钠溶液浸泡12h，蒸馏水洗至中性，最后用5%盐酸溶液浸泡12h，蒸馏水洗至中性，最后用蒸馏水浸泡即可。

进一步的，步骤（2）中，所述蒸发的温度为30℃。

进一步的，步骤（2）中，所述甲醇-0.1%甲酸水溶液的体积比为2:8。

本发明所使用的超高效液相色谱-质谱法中色谱柱为Phenomenex Kinetex:100mm×4.6mm，2.6μm，柱温为35℃，进样量为5μL，流速为1.0mL/min，流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为乙腈，采用梯度洗脱。

进一步的，所述梯度洗脱的条件为：0-1min,5%B；1-2.5 min，5%-50%B；2.5-3.8 min，50%-70%B；3.8-5.0 min，70%-90%B；5.0-6.0 min，90%B；6.0-6.2 min，90%-5%B；6.2-8 min，5%B；采用阀切换功能：0-0.5min切入废液，0.5-4.5min切入质谱，6.0-8min切入废液。

上述质谱法的条件为：气帘气CUR: 35.00；离子源电压IS:5 500.00；离子源温度TEM:550.00；离子源电离反应气体GS1: 55.00

；脱溶剂气体GS2: 55.00；碰撞池气体CAD:7.00。

本发明发明人经过大量实验发现，在蓝莓提取过程中，通过少量加入环己六醇，能够提高花苷类物质的提取率，环己六醇能够抑制蓝莓中糖苷酶、多酚氧化酶的活性，从而提高提取物质的稳定性，同时，多种溶剂混合作用下，能够起到表面活性剂作用，降低其表面张力，从而提高提取率。

本发明的有益效果为：

（1）本发明对对流动相、洗脱程序、色谱柱等条件进行了筛选和优化，选用的方法重复性及稳定性好；

（2）能够快速准确的对蓝莓中的花青苷类物质进行定性及定量检测，检出限低。

附图说明

图1为蓝莓提取液中的花青苷Q1扫描质谱图。

图2为矢车菊-3-芸香糖苷在Kinetex柱上的MRM图。

图3为矢车菊-3-葡萄糖苷在Kinetex柱上的MRM图。

图4为芍药素-3-葡萄糖苷在Kinetex柱上的MRM图。

图5为芍药素-3-芸香糖苷在Kinetex柱上的MRM图

图6为飞燕草-3-葡萄糖苷在Kinetex柱上的MRM图。

图7为矢车菊3-木糖苷在Kinetex柱上的MRM图。

图8矢车菊3-槐糖苷在Kinetex柱上的MRM图。

图9为牵牛花素3-葡萄糖苷在Kinetex柱上的MRM图。

图10为飞燕草素-3-芸香糖苷在Kinetex柱上的MRM图。

图11为不同溶剂提取蓝莓中花青苷类物质的效果图。

具体实施方式

为便于理解发明内容，下面结合具体实施例对本发明进行进一步说明：

实施例1

一种蓝莓中花青苷类物质的检测分析方法，包括以下步骤：

（1）取1-2mm厚蓝莓成熟果实的果皮0.5g，加液氮研磨后，置于离心管中，加入甲醇-0.15%甲酸水-环己六醇15mL(所述甲醇-0.15%甲酸水-环己六醇的体积比为2:8:5)，超声波震荡10min后，首先置于-15℃下保存10min，取出恢复至室温后，再置于4℃下浸提24h，离心，收集上清液；

（2）将上清液通过装入玻璃层析柱的活化完全的HPD-450A大孔树脂进行净化洗脱，收集洗脱液，在30℃下蒸发至浸膏状，用甲醇-0.1%甲酸水溶液（甲醇-0.1%甲酸水溶液的体积比为2:8）复溶并定容至2mL，过滤，得滤液；

所述大孔树脂采用的活化方法为：首先将大孔树脂在质量浓度为15%的氯化钠溶液中浸泡5min，然后置于质量浓度为8%的氯化钠溶液中浸泡2min，蒸馏水冲洗，再用体积分数为95%乙醇浸泡24h，用蒸馏水洗至无味，再用5%氢氧化钠溶液浸泡12h，蒸馏水洗至中性，最后用5%盐酸溶液浸泡12h，蒸馏水洗至中性，最后用蒸馏水浸泡即可；

（3）将滤液采用超高效液相色谱-质谱法进行分析检测。

所述超高效液相色谱-质谱法中色谱柱为Phenomenex Kinetex:100mm×4.6mm，2.6μm，柱温为35℃，进样量为5μL，流速为1.0mL/min，流动相A为0.1%甲酸水溶液，流动相B为乙腈，采用梯度洗脱；

所述梯度洗脱的条件为：0-1min,5%B；1-2.5 min，5%-50%B；2.5-3.8 min，50%-70%B；3.8-5.0 min，70%-90%B；5.0-6.0 min，90%B；6.0-6.2 min，90%-5%B；6.2-8 min，5%B；流速为1.0ml/min；进样量为5μl；采用阀切换功能：0-0.5min切入废液，0.5-4.5min入质谱，6.0-8min切入废液；

所述质谱法的条件为：气帘气CUR: 35.00；离子源电压IS:5 500.00；离子源温度TEM:550.00；离子源电离反应气体GS1: 55.00

；脱溶剂气体GS2: 55.00；碰撞池气体CAD:7.00。

对比例1

一种蓝莓中花青苷类物质的检测分析方法，按照发明人之前发表的文章《超高效液相色谱-串联质谱法测定甜樱桃果皮中花青苷类物质》提供的方法进行检测。

效果实施例

1、将实施例1及采用对比例1的方法进行提取效果的比较，具体结果见图11，从图11中可以看出，采用本发明提供的溶剂体系，显著提高了提取率。

2、本发明对9种花青苷的选择离子谱图见图2-10，在本发明提供的梯度洗脱条件下，9种花青苷能够较好的被分离检测，灵敏度高。

3、线性范围、检出限和定量限

采用含0.1%甲酸的甲醇溶液将飞燕草素-3-葡萄糖苷、矢车菊素-3-槐糖苷、飞燕草素-3-芸香糖苷、矢车菊素-3-葡萄糖苷、牵牛花素3-葡萄糖苷、矢车菊素-3-芸香糖苷、矢车菊素-3-木糖苷、芍药素-3-葡萄糖苷和芍药素-3-芸香糖苷9种花青苷配制成质量浓度分别为0、10、30、50和100μg/L的混合标准溶液，在优化好的液相色谱和质谱条件下进行测定。以定量离子峰面积对质量浓度做标准曲线。结果显示，9种化合物的线性相关系数（r²）为0.9958-0.9996，表明各化合物在0-100μg/L的范围内线性关系良好，能满足检测需求。样品被多次提取花青苷后取其残渣而获得基质空白。采用在空白基质中添加目标化合物的方法，依据色谱峰3倍信噪比确定检出限，以10倍信噪比确定本方法的定量限，具体结果见表1。

表1

4、采用本发明提供的方法对高灌蓝莓品种“蓝丰”和‘喜来’以及兔眼蓝莓株系15-23的成熟果实样品进行了定性和定量检测。设置对照组，采用对比例中的方法进行检测，检测出的种数见表2。

表2

从高灌蓝莓品种‘喜来’和兔眼蓝莓株系15-23中分别检测出9种花青苷类物质，从‘蓝丰’中仅检测出了8种花青苷类物质。不同品种间各花青苷类物质的含量差异显著。具体含量见表3。

表3