一种基于角蛋白自荧光作为预测检测肿瘤的生物标志物的检测方法及其应用与流程

本发明涉及预测和检测肿瘤组织的生物标志物，具体是基于检测肿瘤组织中角蛋白自荧光变化，作为预测和检测肿瘤位置的生物标志物的检测方法及其应用。

背景技术：

在上皮细胞中，根据不同的细胞种类，分化程度和功能状态，都会有特殊的角蛋白表达。事实表明，在肿瘤中，上皮肿瘤细胞很大程度上保留了原先的角蛋白的亚型。根据这个角蛋白已经被用来作为鉴别肿瘤细胞来源的标志物，其中最常用的是腺癌。

现在全球早期发现癌症的关键在于肿瘤筛查的方法。目前已有的检查方法包括体检各种血液指标，B超、X光、肛门直肠指检，妇科体检中的巴氏涂片、乳腺钼钯摄片等。同时在临床上，手术过程中如何迅速判断肿瘤组织是否被彻底切除，还有着重大的临床意义。

现在临床上手术中主要使用切片染色，判断肿瘤组织手否被切除完全。这种方法不仅需要等待很长时间，而且不能完全确定是否肿瘤组织已经被完全切除。

有研究发现，一些内皮恶性肿瘤组织中角蛋白1含量显著增加。而至今没有无创检测组织中角蛋白1含量的方法。

所以，急需一种实时检测肿瘤组织的方法。

技术实现要素：

本发明的目的是克服现有技术的不足，本发明基于紫外可以诱导角蛋白1自荧光的上升这一全新发现，突破了现有技术的难题，找到了一种可以准确地迅速地检测恶性肿瘤组织的生物标志物。并且基于该生物标志物，发明了新的无创检测肿瘤组织的方法。

本发明的具体技术方案是：

一种基于角蛋白自荧光作为预测检测肿瘤的生物标志物的检测方法，包括以下步骤：

(1) 在实验对象的肿瘤组织受到包含一定剂量紫外光的光源照射后24小时之内，检测所述实验对象经过含紫外光的光源照射的肿瘤组织中角蛋白的自荧光，其中所述剂量 = 紫外光功率×照射时间；

(2) 检测所述实验对象经过含紫外光的光源照射的肿瘤组织所发出的波长在490-640nm范围内的自发荧光强度；

(3) 按照所述步骤(2)的方法，同样检测所述实验对象受到含紫外光的光源照射的肿瘤区域附近组织的自荧光强度；

(4) 将所述实验对象经过含紫外光的光源照射的肿瘤组织自荧光和受到含紫外光的光源照射的肿瘤区域附近组织的自荧光强度相对比，获得经紫外光照射诱发的自发荧光强度变化率；

(5) 根据所述经紫外光照射诱发的角蛋白自荧光强度变化率，预测检测所述被实验对象的恶性肿瘤组织位置。

进一步的，所述肿瘤组织包括肺、肝脏、肾、前列腺、子宫、皮肤等部位的肿瘤。

进一步的，所述肿瘤类型为腺癌和皮肤癌。

进一步的，所述肿瘤组织包括肺、肝脏、肾、前列腺、子宫、皮肤等部位的肿瘤。

进一步的，所述检测样本中角蛋白1自荧光的的方法中，通过一定剂量的紫外光刺激的作用是，放大角蛋白1自荧光的信号。紫外光剂量小于等于100焦耳/平方厘米之间。

进一步的，所述利用激发光激发角蛋白1自荧光的方式包括使用普通的连续光输出进行激发的方式、使用电调制进行调制激发的方式或者使用脉冲激光进行激发的方式中的至少一种。

进一步的，所述角蛋白1自荧光特征在于光谱范围在400-600nm。

进一步的，所述角蛋白1自荧光特征在于光谱范围在450-550nm。

进一步的，所述角蛋白1自荧光特征在于光谱范围在460-500nm。

本发明还提供一种基于检测角蛋白1自荧光变化预测检测恶性肿瘤组织的生物标志物的应用。

本发明利用恶性肿瘤组织中角蛋白1自荧光强度显著高于正常组织这一现象，为临床检测恶性肿瘤组织建立基础，可以准确且迅速的发现恶性肿瘤组织，使患者得到及时的治疗。既可以在高端精密的医学诊断中得到应用，也可以在便捷、家庭中预测和检测紫外损伤中得到应用，非常利于普及。

附图说明

图1：组织中角蛋白1自荧光光谱图。

图2：角蛋白1RNA干扰对于紫外光诱导的组织自荧光的作用图。

图3：角蛋白1RNA干扰对于紫外光诱导的黑素瘤细胞自荧光的作用图。

具体实施方式

使用雄性C57小鼠，紫外光处理后，小鼠在动物房中进行饲养，条件为22-24℃，12小时的明/暗循环，并可自由进食取水。6小时后，使用激光共聚焦显微镜对皮肤中角蛋白1自荧光进行成像。其中激光共聚焦显微镜的激发波长为440-600 nm。

使用B16-F10细胞，培养在37摄氏度，5%的二氧化碳环境中。对细胞角蛋白1表达量进行干扰下调12小时后。对干扰的以及没有干扰的细胞进行紫外诱导。6小时内，用激光共聚焦显微镜成像。其中激光共聚焦显微镜的激发波长为440-600 nm。

图1：组织中角蛋白1的光谱图，用紫外光诱导之后，光谱分布没有变化。荧光强度增强。

图2：组织中，发现紫外光可以诱导角蛋白1高表达的组织自荧光增强。利用RNA干扰的方法将角蛋白1的表达量降低，紫外诱导后自荧光增强程度减弱。

图3：黑素瘤细胞模型中，发现紫外光可以诱导角蛋白1表达的细胞自荧光增强。利用RNA干扰的方法将角蛋白1的表达量降低，紫外诱导后自荧光增强程度减弱。

下面将通过具体描述，对本发明作进一步的说明。

除非另有限定，本文中所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解相同的含义。

发明人进行了大量的实验，确定了肿瘤组织角蛋白自荧光显著高于正常组织这一现象。

由以上实验可以得出，肿瘤组织角蛋白自荧光显著高于正常组织。因此，表皮角蛋白自荧光能够作为检测肿瘤组织的标志物。

本发明基于这一发现，建立了一种活体无创无标记检测肿瘤组织的方法。该方法包括以下步骤：

(1) 在实验对象的肿瘤组织受到包含一定剂量紫外光的光源照射后72小时之内，检测所述实验对象经过含紫外光的光源照射的肿瘤组织中角蛋白的自荧光，其中所述剂量 = 紫外光功率×照射时间；

(2) 检测所述实验对象经过含紫外光的光源照射的肿瘤组织所发出的波长在490-640nm范围内的自发荧光强度；

(3) 按照所述步骤(2)的方法，同样检测所述实验对象受到含紫外光的光源照射的肿瘤区域附近组织的自荧光强度；

(4) 将所述实验对象经过含紫外光的光源照射的肿瘤组织自荧光和受到含紫外光的光源照射的肿瘤区域附近组织的自荧光强度相对比，获得经紫外光照射诱发的自发荧光强度变化率；

(5) 根据所述经紫外光照射诱发的角蛋白自荧光强度变化率，预测检测所述被实验对象的肿瘤组织位置。

前述发明的利用激发光激发肿瘤组织角蛋白自荧光的方式包括使用普通的连续光输出进行激发的方式、使用电调制进行调制激发的方式或者使用脉冲激光进行激发的方式中的至少一种。

前述本发明的检测方法中，优选腺癌和皮肤癌。

前述本发明的检测方法中，优选的是，肺、前列腺、肾、子宫、皮肤上的肿瘤组织。

前述本发明的检测方法中，紫外光波长为200纳米-400纳米

前述本发明的检测方法中，紫外光剂量为0-100焦耳/平方厘米，优选为0-20焦耳/平方厘米，更优选为0-10焦耳/平方厘米。

前述本发明的检测方法中，所检测的自发荧光的波长优选为450-550 nm的范围内，更优选为460-500 nm的范围内。

本领域的技术人员应当明了，尽管为了举例说明的目的，本文描述了本发明的具体实施方式，但可以对其进行各种修改而不偏离本发明的精神和范围。因此，本发明的具体实施方式和实施例不应当视为限制本发明的范围。本发明仅受所附权利要求的限制。本申请中引用的所有文献均完整地并入本文作为参考。