本发明涉及一种proANP快速检测试纸卡及相关应用，属于临床检测领域。
背景技术：
：心力衰竭是各种心脏结构或功能性疾病导致心室充盈和(或)射血能力受损而引起的一组综合征，它是老年人住院或者死亡的最常见原因之一。随着人口老龄化及心肌梗死生存率的上升，心力衰竭作为心血管疾病中唯一一个发病率和流行性仍在持续上升的疾病，其防治已成为近年来临床心脏病学研究的热点。心钠素前体(proANP)由心肌细胞合成，储存在分泌颗粒中，激素释放进入血液循环的主要刺激来自心肌细胞的伸展。心钠素前体释放时分解为等分子的具有生物活性的proANP(99-126)和N末端proANP(1-98)，后者较前者稳定，对心钠素的波动分泌比较不敏感，可以较好地反映心钠素的慢性分泌水平。在心衰患者血液中心钠素和脑钠素均升高，其血浆浓度与心衰的严重程度成正比。数据表明，proANP可能是早期心脏功能失调的一个明显的生物标志物。目前，针对proANP的检测方法主要为酶联免疫法(ELISA)和放射免疫分析法；并且主要依赖于进口，但是ELISA法定量准确性差、操作时间长、自动化程度低，多用于定性检测；放射免疫分析法灵敏度较高，操作简单，测量准确，缺点是所需时间较长，存在放射性污染和辐射危险；胶体金免疫层析方法虽然具有样本用量少，简便快速，成本低的优势，但是灵敏度较低，一般只能定性，不能定量，特别是重复性差这一缺点限制了其在临床上的应用，尤其不适用于需通过准确定量来帮助对疾病进行诊断的体液标志蛋白的定量检测。荧光免疫层析是建立在酶联免疫吸附试验、乳胶凝集试验、单克隆抗体技术和免疫荧光微球标记技术基础上的以荧光微球为标记物,利用特异的抗原抗体反应来放大反应，通过荧光定量分析仪判定结果的新技术。该技术具有简单、快速、准确和无污染等优点，在临床医学检测、激素检测、食品安全检测、药物残留和毒品快速检测诸多诊断领域迅速发展。技术实现要素：本发明的目的是提供一种心钠素前体(proANP)定量荧光免疫层析检测试纸卡；所述试纸卡是在PVC板上顺次相互搭接经过处理的样品垫、吸附有稀土荧光微球标记抗体的结合垫、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫，组装后形成试纸卡。在本发明的一个实施方案中，所述稀土荧光微球掺杂有铕元素；所述稀土荧光微球的直径为50-100nm。在本发明进一步地实施方案中，吸附有稀土荧光微球标记抗体的制备方法如下：1、稀土荧光微球的活化；2、稀土荧光微球标记的proANP抗体的制备：将proANP单克隆抗体用与上述活化的稀土荧光微球混合，反应过夜；然后加入硼氢化钠反应；再加入等体积的封闭液，封闭过夜；离心洗涤3遍，重悬于的100mMTris-HCl缓冲液中(含0.5％BSA和0.2％木质素磺酸钠)，4℃避光保存备用。在一个具体实施方案中，所述封闭液组成为含1.0％BSA和0.1％木质素磺酸钠的50mMTris-HCl缓冲液，pH6.5。在本发明另一个实施方案中，所述吸附荧光微球标记的抗体的结合垫通过以下方法制备：将玻璃纤维膜浸泡于含2.5％木质素磺酸钠和2.5％BSA的100mMTris-HCl缓冲液中，pH7.0；浸泡，然后取出烘箱烘干，将玻璃纤维膜置于喷台上，用微定量喷头将稀土荧光微球标记的proANP单克隆抗体溶液喷到玻璃纤维膜，即得。在本发明又一个实施方案中，所述包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜的制备方法如下：用包被稀释液将proANP单克隆抗体和羊抗小鼠IgG抗体制成溶液，将它们分别作为检测线和质控线平行喷洒于硝酸纤维素膜上进行包被，然后置于烘箱中烘干。在一个具体实施方案中，所述包被稀释液为含0.5％木质素磺酸钠的100mMTris-HCl缓冲液，pH7.0。在本发明又一个实施方案中，所述样品垫的制备方法如下：将玻璃纤维膜浸泡于0.25MTris缓冲液(pH7.5)，含1.2％TritonX-100，2.5％BSA的处理液中，于4℃浸泡4个小时，然后置于烘箱中，37℃烘干4小时。在本发明中，所述试纸卡的组装过程如下：在PVC板上依次粘贴经过处理的样品垫、吸附有稀土荧光微球标记的抗体的结合垫、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫，组装后得到试纸大板，按照要求切割成4mm宽，将试纸装入塑料卡内形成试纸卡。所述试剂盒，检测方法为：1)将检测试剂及样本平衡至室温，取出试纸卡，平放；2)精确吸取100μl血清样本，样本为全血时吸取150μl样本，加入到样本孔中，15-30分钟内用荧光免疫层析分析仪定量判定结果；3)设置好仪器相关参数后将试纸卡放入仓内进行检测，仪器将显示出样品浓度的定量测定结果。在荧光免疫层析试纸卡的制备过程中，一般在封闭和涂布抗体或荧光微球标记抗体过程中，会加入表面活性剂来辅助封闭和维持抗体稳定性的作用。但是本领域常用的TritonX-100、吐温20和PVP等，但是对于荧光标记抗体来说，传统表面活性剂的稳定性作用不佳，并且荧光微球中铕元素的发光强度随着保存时间延长而明显减弱，而本发明发现当封闭液及涂布液中添加木脂素磺酸钠作为表面活性剂时，不仅抗体稳定性效果极佳，并且荧光微球发光强度随着时间延长没有出现减弱现象。具体实施方式还可进一步通过实施例来理解本发明，其中所述实施例说明了一些制备或使用方法。然而，要理解的是，这些实施例不限制本发明。现在已知的或进一步开发的本发明的变化被认为落入本文中描述的和以下要求保护的本发明范围之内。在本发明中，在无特殊说明的前提下，“％”代表重量百分比。实施例1proANP检测试纸卡制备包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜的制备：用包被稀释液将proANP单克隆抗体和羊抗小鼠IgG抗体调整浓度到5mg/ml，膜液量为2μl/cm，将它们分别作为检测线和质控线平行喷洒于硝酸纤维素膜上进行包被，检测线和质控线间隔为5mm，然后置于烘箱中，37℃烘干4小时。包被稀释液为含0.5％木质素磺酸钠的100mMTris-HCl缓冲液，pH7.0。吸附荧光微球标记的抗体的结合垫制备：1、稀土荧光微球的醛基化：取15mg稀土荧光微球，用50mM，pH9.0的碳酸盐缓冲液，采用离心法洗涤3遍，离心速度为12000rpm，时间为10分钟，最后重悬于200μl的上述碳酸盐缓冲液中。加入400μl醛基化的葡聚糖，混匀，室温下暗反应4小时。采用同样的离心法洗涤和重悬到200μl的上述碳酸盐缓冲液中，置于4℃备用。2、稀土荧光微球标记的proANP抗体的制备：将5mg的proANP单克隆抗体用上述碳酸盐缓冲液于4℃透析过夜，然后与上述醛基化的稀土荧光微球混合，4℃反应过夜。然后，加入硼氢化钠至终浓度15mM，4℃反应6小时；再加入等体积的封闭液(50mM的Tris-HCl缓冲液，pH6.5，含1.0％BSA和0.1％木质素磺酸钠)，4℃封闭过夜；然后用50mMpH6.5的Tris-HCl缓冲液，采用离心法洗涤3遍，重悬于200μl的100mMTris-HCl缓冲液中(含0.5％BSA和0.2％木质素磺酸钠)，4℃避光保存备用。3、将玻璃纤维膜浸泡于100mMTris-HCl缓冲液中(含2.5％木质素磺酸钠，2.5％BSA，pH7.0)，4℃浸泡4小时，然后取出37℃烘箱烘干4小时，备用。将玻璃纤维膜在Bio-DotXYZ3050三维喷点平台上，用Bio-JetQuanti300非接触式微定量喷头将稀土荧光微球标记的proANP单克隆抗体溶液喷到玻璃纤维膜，37℃烘干4小时，备用。在检测线中涂布的proANP单克隆抗体和结合垫中的荧光微球标记用的proANP单克隆抗体为配对抗体，均为N末端proANP(NT-proANP)单克隆抗体，购自Genetex公司(USA)。试纸卡的组装：在PVC板上依次粘贴经过处理的样品垫、吸附有稀土荧光微球标记的抗体的结合垫、包被有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫，组装后得到试纸大板，按照要求切割成4mm宽，将试纸装入塑料卡内形成试纸卡。实施例2试纸卡线性范围、精密度和灵敏度测试取含量为0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10和20nmol/L的proANP标准品溶液，用试纸卡进行测定。检测方法：将检测试剂及样本平衡至室温，取出试纸卡(实施例1制备)，平放；精确吸取100μl标准品样本，加入到试纸卡的样本孔中，20分钟后用荧光免疫层析分析仪进行检测。线性：以荧光强度值和对应的标准品浓度建立标准曲线，具体为Y(荧光强度)＝116.27X+3.4，R2值>0.999，说明本发明试纸卡在0.01-2020nmol/L范围内线性良好。灵敏度：采用PBS缓冲液作为空白对照，以空白对照2倍荧光强度作为最低检测浓度(即灵敏度)，结果表明：0.01nmol/L标准品平行测定5次的平均荧光强度为4.7RLU；而空白对照的平均荧光强度为1.4RLU。说明试纸卡的灵敏度可达0.01nmol/L。精密度：取已知高浓度和低浓度proANP含量的全血样本，样本proANP含量分别为0.68nmol/L和8.43nmol/L；采用实施例1制备试纸卡重复测定10次，计算CV。结果表明proANP含量为0.68nmol/L的低浓度样本的CV为2.06％；高浓度样本的CV为1.41％。实施例3稳定性测试将实施例1制备的试纸卡在37℃环境下放置3个月，然后按照实施例2的方法测定试剂盒的标准曲线及R2值，并采用1nmol/L的proANP标准品对试剂盒进行精密度考察(平行测定10次，计算CV％)，具体结果如下：对比例1试纸卡制备同实施例1，区别在于，在制备各步骤中不添加木质素磺酸钠。对比例2试纸卡制备同实施例1，区别在于，在制备各步骤中将木质素磺酸钠替换为等量的SDS。对比例3试纸卡制备同实施例1，区别在于，在制备各步骤中将木质素磺酸钠替换为等量的吐温20。对比例4试纸卡制备同实施例1，区别在于，在结合垫制备步骤3中将木质素磺酸钠含量为3.5％。实施例4临床测试从医院收集心衰患者及健康人的血液样本，采用实施例1试纸卡对样本进行测定，并且采用相同样本通过放射免疫方法进行测定，结果见下表：样本编号实施例1放免法11.34nmol/L1.36nmol/L20.89nmol/L0.87nmol/L31.59nmol/L1.63nmol/L45.63nmol/L5.67nmol/L57.27nmol/L7.29nmol/L65.92nmol/L5.99nmol/L本
发明内容仅仅举例说明了要求保护的一些具体实施方案，其中一个或更多个技术方案中所记载的技术特征可以与任意的一个或多个技术方案相组合，这些经组合而得到的技术方案也在本申请保护范围内，就像这些经组合而得到的技术方案已经在本发明公开内容中具体记载一样。当前第1页1 2 3