一种基于显微多模态融合光谱技术的食源性致病微生物检测方法与流程

本发明涉及一种基于显微多模态融合光谱技术的食源性致病微生物检测方法，具体涉及拉曼光谱技术、可见-近红外光谱技术和与显微成像技术的独特性质相结合，既可用于常规近红外光谱和拉曼光谱检测研究，还可通过显微模块，用于微观领域的拉曼光谱和近红外光谱同步分析，实现不同技术之间的优势互补，为食源性微生物快速、灵敏检测提供优势平台。

背景技术：

食源性致病菌是引起食源性疾病的首要原因，对人类健康造成很大危害，是食品安全的重大隐患。常用的食源性致病菌分析方法目前主要有传统的微生物检验技术、分子生物学技术、仪器分析技术和免疫学技术。现有的这些分析方法虽各有优势，但都存在一定的局限性，或者前处理步骤复杂、时间长，或者仪器设备庞大昂贵、不能对微生物进行可视化分析等。鉴于申请人在食品无损检测领域积累了良好的工作基础，本发明拟构建一套显微多模态融合光谱系统，深入研究快速、灵敏的食源性微生物检测方法，该方法适用于食品安全、环境监测等技术领域。

目前，用显微多模态融合光谱技术实现食源性致病微生物检测方法仍未见报道。本发明作为一种新兴的食源性微生物检测方法，实现了食源性微生物快速、灵敏检测分析。

技术实现要素：

本发明的目的是提供了一种基于显微多模态融合光谱技术的食源性致病微生物检测方法，其灵敏度高、可靠性强、检测速度快，实现了食源性致病微生物的检测分析，适用于食品安全、环境监测等技术领域。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案：以食源性致病微生物为研究对象，创造性提出一套显微多模态融合光谱的检测新方法，并构建检测平台，用于食源性致病微生物的快速高通量检测。本研究通过拉曼光谱和近红外光谱技术的优势互补，首先，在显微拉曼光谱独立模式下，制备增强基底结合标记分子、特异性识别分子构建生物标记纳米探针，利用所制备生物标记纳米探针，对微生物进行特异性标记，采集不同浓度食源性致病菌菌液的拉曼光谱；随后，在显微近红外光谱模式下，采集不同菌液的近红外光谱信号，利用智能搜索及数据降维手段挖掘出与菌液密切相关的特征变量，与拉曼标记峰相融合，建立融合光谱强度与菌液浓度关系的标准曲线，确定食品中食源性微生物的检测限，实现基于融合光谱技术的食源性微生物特异性定量检测。该方法适用于食品安全、环境监测等技术领域。

上述的一种基于显微多模态融合光谱技术的食源性致病微生物检测方法，所构建检测平台，国内外尚无相关产品。本设备是近红外光谱技术、拉曼光谱技术和显微成像技术的交叉融合，既可获取微观尺度上的光谱信息，还可分辨微观层面上的细微特征，实现不同技术之间的优势互补，设备在研制过程将在显微拉曼光谱技术和显微近红外光谱技术的有机集成方法、激光激发光源模组、系统平台多模态切换方式等方面实现突破性研究。

上述的一种基于显微多模态融合光谱技术的食源性致病微生物检测方法，所构建检测平台是将拉曼光谱技术、可见-近红外光谱技术和与显微成像技术的独特性质相结合，既可用于常规近红外光谱和拉曼光谱检测研究，还可通过显微模块，用于微观领域的拉曼光谱和近红外光谱同步分析，实现不同技术之间的优势互补，为食源性微生物快速定量检测提供优势平台。上述的一种基于显微多模态融合光谱技术的食源性致病微生物检测方法，所述检测方法是以食品安全的主要来源食源性微生物为研究对象，研究食品安全因子多种模态下融合光谱的解析机理，产生拉曼增强信号机理、食品安全因子的高分辨快速检测等科学问题，为食品安全快速检测提供理论基础。

上述的一种基于显微多模态融合光谱技术的食源性致病微生物检测方法，所制备增强基底是采用种子生长法，以十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和含有双键的阴离子十二烷基苯基磺酸钠(SDBS)作为表面活性剂胶束模板，在可溶性金源、可溶性银盐、抗坏血酸、硼氢化钠共同存在的酸性条件下，经过陈化，得到金纳米棒增强基底。制备过程中，通过调节不同表面活性剂浓度，考察其对金纳米棒尺寸、形貌、长径比、光学性质对表面增强拉曼信号的影响。最终，将优化后SERS基底的形貌、等离子体共振吸收(LSPR)。

上述的一种基于显微多模态融合光谱技术的食源性致病微生物检测方法，所述的数据降维手段主要通过目标导向筛选出几个最优区间组合，剔除全光谱区域内大量与检测目标无关的变量；接着，应用智能搜索方法，从最优区间组合中对变量进行进一步优选，剔除相邻波长间具有高度共线性的冗余变量，从而优选出特定尺度下的特征光谱变量。

上述的一种基于显微多模态融合光谱技术的食源性致病微生物检测方法，该方法包括如下具体步骤：

1)食源性微生物样本准备：首先将微生物的菌株分别接于Luria-Bertani培养基中于37℃培养24h，然后以转速5000g离心5min，弃上清液，并用超纯水清洗三次，分别重新分散于超纯水。最后将所获得的细菌菌液分别进行10倍梯度稀释，获得8个梯度的菌液储存备用，同时采用菌落平板计数法分别确定细菌具体的菌落数量。

2)增强基底制备：增强基底金纳米棒的合成是利用种子生长法，在十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)(0.2M)胶束水溶液中加入硝酸银。混合物反应20min，直到颜色变成红葡萄酒。随后，将硫酸钠加入至混合溶液中进行进一步生长。最终，将硫化处理后的金纳米棒收集离心(9000转，30分钟)，用纯水洗三次，最后分散在超纯水储存在4℃的进一步使用。

3)拉曼光谱采集：利用所制备生物标记纳米探针，对微生物进行特异性标记，在150cm-1-2000cm-1波长范围内采集不同浓度食源性致病菌菌液的拉曼光谱信号。

4)近红外光谱采集：在显微拉曼光谱独立模式下，采集不同浓度食源性致病菌菌液的近红外光谱信号。

5)数据处理及分析：采集不同菌液的近红外光谱信号后，利用智能搜索及数据降维手段挖掘出与菌液密切相关的特征变量，与拉曼标记峰相融合，建立融合光谱强度与菌液浓度关系的标准曲线，确定食品中食源性微生物的检测限，实现基于融合光谱技术的食源性微生物特异性定量检测。

与现有的技术相比，本发明的优点在于：

本发明所构建的检测平台，国内外尚无相关产品。本设备是近红外光谱技术、拉曼光谱技术和显微成像技术的交叉融合，既可获取微观尺度上的光谱信息，还可分辨微观层面上的细微特征，实现不同技术之间的优势互补，设备在研制过程将在显微拉曼光谱技术和显微近红外光谱技术的有机集成方法、激光激发光源模组、系统平台多模态切换方式等方面实现突破性研究。

本发明涉及的一种基于显微多模态融合光谱技术的食源性致病微生物检测方法易于操作，灵敏度高，检测速度快，在食品安全、环境监测等技术领域广泛应用。

本发明所构建检测平台是将拉曼光谱技术、可见-近红外光谱技术和与显微成像技术的独特性质相结合，既可用于常规近红外光谱和拉曼光谱检测研究，还可通过显微模块，用于微观领域的拉曼光谱和近红外光谱同步分析，实现不同技术之间的优势互补，为食源性微生物快速定量检测提供优势平台。

本发明所制备的增强基底是采用种子生长法，以十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和含有双键的阴离子十二烷基苯基磺酸钠(SDBS)作为表面活性剂胶束模板，在可溶性金源、可溶性银盐、抗坏血酸、硼氢化钠共同存在的酸性条件下，经过陈化，得到金纳米棒增强基底。制备过程中，通过调节不同表面活性剂浓度，考察其对金纳米棒尺寸、形貌、长径比、光学性质对表面增强拉曼信号的影响。最终，将优化后SERS基底的形貌、等离子体共振吸收(LSPR)。

本发明涉及的数据降维手段主要通过目标导向筛选出几个最优区间组合，剔除全光谱区域内大量与检测目标无关的变量；接着，应用智能搜索方法，从最优区间组合中对变量进行进一步优选，剔除相邻波长间具有高度共线性的冗余变量，从而优选出特定尺度下的特征光谱变量。

附图说明

图1为试验方法检测大肠杆菌的流程图；

图2增强基底表征图；(A)为优化后SERS基底的形貌；(B)为不同长径比基底物对SERS强度的影响；(C)为等离子体共振吸收(LSPR)特性表征；

具体实施方式

实施实例1

为了进一步验证本发明所述方法对食源性致病微生物进行检测，本发明实例，以大肠杆菌(E.coli)为例，具体操作步骤如下：

(1)大肠杆菌样本准备：首先将大肠杆菌的菌株分别接于Luria-Bertani培养基中于37℃培养24h，然后以转速5000g离心5min，弃上清液，并用超纯水清洗三次，分别重新分散于超纯水。最后将所获得的细菌菌液分别进行10倍梯度稀释，获得8个梯度的菌液储存备用，同时采用菌落平板计数法分别确定细菌具体的菌落数量。试验方法检测大肠杆菌的流程图如图1所示。

(2)增强基底制备：增强基底金纳米棒的合成是利用种子生长法，在十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)(0.2M)胶束水溶液中加入硝酸银。混合物反应20min，直到颜色变成红葡萄酒。随后，将硫酸钠加入至混合溶液中进行进一步生长。最终，将硫化处理后的金纳米棒收集离心(9000转，30分钟)，用纯水洗三次，最后分散在超纯水储存在4℃的进一步使用。图2为优化后SERS基底的形貌(A)、不同长径比基底物对SERS强度的影响及等离子体共振吸收(LSPR)特性(C)表征；

(3)拉曼光谱采集：利用所制备生物标记纳米探针，对微生物进行特异性标记，在150cm^-1-2000cm^-1波长范围内采集不同浓度食源性致病菌菌液的拉曼光谱信号。

(4)近红外光谱采集：在显微拉曼光谱独立模式下，采集不同浓度大肠杆菌菌液的近红外光谱信号。

(5)数据处理及分析：采集不同菌液的近红外光谱信号后，利用智能搜索及数据降维手段挖掘出与菌液密切相关的特征变量，与拉曼标记峰相融合，建立融合光谱强度与大肠杆菌菌液浓度关系的标准曲线，确定食品中食源性微生物的检测限，实现基于融合光谱技术的大肠杆菌特异性定量检测。

综上，本发明涉及一种基于显微多模态融合光谱技术的食源性致病微生物检测方法。该方法为：以食源性致病微生物为研究对象，创造性提出一套显微多模态融合光谱的检测新方法，并构建检测平台，用于食源性致病微生物的快速高通量检测。本研究通过拉曼光谱和近红外光谱技术的优势互补，首先，在显微拉曼光谱独立模式下，制备增强基底结合标记分子、特异性识别分子构建生物标记纳米探针，利用所制备生物标记纳米探针，对微生物进行特异性标记，采集不同浓度食源性致病菌菌液的拉曼光谱；随后，在显微近红外光谱模式下，采集不同菌液的近红外光谱信号，利用智能搜索及数据降维手段挖掘出与菌液密切相关的特征变量，与拉曼标记峰相融合，建立融合光谱强度与菌液浓度关系的标准曲线，确定食品中食源性微生物的检测限，实现基于融合光谱技术的食源性微生物特异性定量检测。该方法适用于食品安全、环境监测等技术领域。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示意性实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。