本发明属于中药指纹图谱领域，具体地说，涉及基于hpce建立新疆紫草指纹图谱的方法及应用。
背景技术：
紫草是我国传统中药材，2015版《中华人民共和国药典》收载的紫草为紫草科植物新疆紫草arnebiaeuchroma(royle)johnst.或内蒙紫草arnebiaguttatabunge的干燥根。紫草味甘、咸，性寒，归心、肝经，具有清热凉血、活血解毒、透疹消斑的功能，用于血热毒盛，斑疹紫黑，麻疹不透，疮疡，湿疹，水火烫伤等的治疗，是中医临床常用的清热解毒、凉血止血药物。药理学研究表明紫草还具有杀菌抗炎、护肝、抗hiv、抗生育、抗肿瘤、延缓衰老以及免疫调节等作用。
紫草的有效化学成分主要有两大类，一类是脂溶性成分，主要是萘醌类色素，统称总色素；此外还含有酚酸类、生物碱类、苯酚及苯醌类、三萜酸及甾醇类、黄酮类等；另一类是水溶性成分，主要是紫草多糖。从结构角度看，紫草中有效成分萘醌类主要包括紫草素及其衍生物，有乙酰紫草素、异丁酰紫草素等，其母核均为5，8－二羟基萘醌，且都具有异己烯侧链。脂肪酸的成分主要有软脂酸、油酸及亚油酸等；紫草的水溶性成分是酸性多糖(含量2％左右)和酚酸。紫草水提物及醇提物都有一定的抗炎、镇痛作用。2015版《中国药典》规定紫草羟基萘醌总色素以左旋紫草素计不得少于0.8％，β,β′-二甲基丙烯酰阿卡宁不得少于0.3％。显然质量控制还不够完全。因此需要建立紫草的指纹图谱，为紫草的质量评价和控制提供更有力的依据，同时为其鉴别提供依据。
指纹图谱技术能对中药进行整体、宏观和全面的分析表达，已被公认为天然药物质量控制最有效的方法之一。目前紫草的分析方法主要有薄层扫描法(tlc)、紫外-可见分光光度法、气相色谱法(gc)、液相色谱法(hplc)。薄层扫描法操作程序过多，影响因素不易消除；tlc常需配合一些辅助手段，过程复杂；hplc分析时间长、试剂成本高、样品处理较繁琐。李方悦、江林等均采用hplc法建立了新疆紫草的指纹图谱。但由于新疆紫草的成分复杂，需要采用梯度洗脱，时间长，处理繁琐，分析成本高且污染环境。新疆紫草是国家二级保护植物，是紫草的主要来源，有道地药材之誉。因此需要一种方便快捷、稳定可靠的分析方法来建立新疆紫草的指纹图谱，来进行更完善的质量控制。
毛细管电泳(capillaryelectrophoresis，ce)，又称高效毛细管电泳(highperformancecapillaryelectrophoresis，hpce)，是一种高效分离技术，具有高效、快速、进样体积小、溶剂消耗少和抗污染能力强等特点，在中药有效成分分析、指纹图谱研究方面显示出显著的优势。目前尚未见基于hpce建立的新疆紫草的指纹图谱的方法。
本申请人在先发表的文章“毛细管电泳分离法检测新疆紫草中萘醌类成分”中，利用毛细管电泳对新疆紫草中的萘醌类成分进行了检测分离。实验条件为检测波长200nm，运行缓冲液为含20％乙醇的硼酸盐缓冲液(0.1mol·l-1，ph＝8.0)，进样量3.45kpa×5s，分离电压20kv。但该技术制备粗提物后对萘醌类成分进一步处理的较为繁琐，对紫草的有效成分紫草素的分离效果也较差，对新疆紫草提取物其它成分的检测效果和分离效果不好，同时为降低200nm检测波长下溶剂峰的干扰，因此需进一步探索更优良的电泳条件。
有鉴于此特提出本发明。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供基于hpce建立新疆紫草指纹图谱的方法及应用。本发明新疆紫草的指纹图谱的方法，样品的前处理简单方便、电泳过程高效快捷、无污染，所得谱图特征峰多，稳定性高，可控性好，可以为新疆紫草的质量控制提供依据，并为区别新疆紫草、内蒙紫草及其他类型紫草提供了鉴别方法。
为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：
本发明的第一目的是提供一种基于hpce建立新疆紫草指纹图谱的方法，包括紫草的供试品溶液及对照品溶液的制备、毛细管电泳分析，其中，毛细管电泳分析中的运行缓冲液包括15～35mmol·l-1的十二烷基硫酸钠(sds)。
本发明在毛细管电泳的运行缓冲液中添加了15～35mmol·l-1的sds，基线平稳，峰数目多，各组分的分离度好。
进一步的方案，所述sds的浓度为25～35mmol·l-1；
优选地，sds的浓度为25mmol·l-1。
在毛细管电泳的运行缓冲液中添加不同终浓度的sds对分离度的影响也不同，一定范围内。随sds浓度的增加，微乳液滴的稳定性增加，运行缓冲溶液对疏水性组分的增溶能力也增强，对脂溶性组分的分离能力增强。实验证明含有浓度25～35mmol·l-1sds的电泳缓冲液的分离度更好；sds达到一定浓度后，分离度改善不大，而各组分特征峰出峰时间延长。经过大量的筛选试验，本发明综合考虑电泳图的分离度和样品的分析时间，在毛细管电泳中，选择使用含有浓度为25mmol·l-1sds的运行缓冲液进行电泳的分离度和分离时间最为理想。
进一步的方案，运行缓冲液中还包括体积分数为10％～30％的无水乙醇。
本发明的运行缓冲溶液中添加了一定比例的无水乙醇，提高了sds的表面活性作用，对样品有增溶作用，同时，在本发明中的运行缓冲溶液条件下，无明显溶剂峰出现，故不会产生样品峰和溶剂峰融合这一现象，不影响分离度。
优选地，运行缓冲液中包括体积分数为20～25％的无水乙醇；
更优选地，运行缓冲液中无水乙醇的体积分数为20％。
进一步的方案，运行缓冲液还包括磷酸缓冲液或硼酸盐缓冲液，优选硼酸盐缓冲液；
所述硼酸盐缓冲液的ph为7.4～9.0，优选地，硼酸盐缓冲液的ph＝8.0。
进一步的方案，所述硼酸盐缓冲液的浓度为100～200mmol·l-1；
优选地，所述硼酸盐缓冲液的浓度为100～150mmol·l-1；
更优选地，所述硼酸盐缓冲液的浓度为100mmol·l-1。
进一步的方案，所述毛细管电泳分析中分离电压为13～25kv，优选地，分离电压为20～25kv，更优选地，分离电压为25kv。
分离电压为13～25kv范围内时，能够得到多个特征峰，随着电压的升高，分离时间越短，但分离度无明显差异，分离电压为20～25kv的分离时间明显短于分离电压为13kv、16kv的分离时间。分离电压为25kv时，分离度较好，可以明显提高柱效，缩短分离时间，基线平稳。因此最优选方案的分离电压为25kv。
进一步的方案，所述毛细管电泳分析的条件为：
运行缓冲液包括ph＝8.0的100mmol·l-1硼酸盐缓冲液、25mmol·l-1的sds和体积分数为20％的无水乙醇；
分离电压：25kv，检测波长214nm。
进一步的方案，紫草的对照品溶液和供试品溶液的进样量为3.45kpa×3s～3.45kpa×5s，优选地，进样量为3.45kpa×5s。
进一步的方案，新疆紫草的供试品溶液的制备方法为：取新疆紫草药材，加无水乙醇超声提取，减压抽滤；再将滤渣加无水乙醇，超声过滤；将两次滤液合并，旋蒸浓缩后再加运行缓冲溶液定容，得到供试品溶液。
进一步的方案，所述毛细管电泳分析采用未涂层的毛细管柱，其内径为50μm，总长度为50.2cm，有效长度为40.0cm。
进一步的方案，所述新疆紫草供试品溶液的制备方法包括：取新疆紫草药材，加无水乙醇超声提取，减压抽滤；再将滤渣加无水乙醇，超声过滤；将两次滤液合并，旋蒸浓缩后再加运行缓冲溶液定容，得到供试品溶液。
进一步的方案，所述对照品溶液为用运行缓冲溶液配制的左旋紫草素和乙酰紫草素的混合液。
本发明的第二目的是提供基于hpce建立的新疆紫草指纹图谱的方法在评价新疆紫草质量或者鉴别紫草类型中的应用；
进一步地，在鉴别新疆紫草、内蒙紫草及其他类型紫草中的应用；
更进一步地，在在鉴别新疆紫草、内蒙紫草中的应用。
采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
1、本发明首次采用hpce技术建立了新疆紫草的指纹图谱的方法，样品处理简单、高效快捷、无污染、成本低。通过各种电泳条件的筛选，获得了最佳的电泳条件，在实验电泳条件下，能得到较多的色谱峰，所得谱图的相对保留值也十分稳定；方法学考察证明，建立的指纹图谱方法稳定性高，重现性好，可控性好。
2、本发明利用建立的新疆紫草的指纹图谱的方法，对不同产地或购买地的新疆紫草进行了相似度评价，可为新疆紫草的质量控制提供依据；另外，还可以为区别新疆紫草和内蒙紫草及其他类型紫草提供鉴别方法。
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。
附图说明
附图作为本发明的一部分，用来提供对本发明的进一步的理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但不构成对本发明的不当限定。显然，下面描述中的附图仅仅是一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。在附图中：
图1是实施例一的新疆紫草供试品1和对照品(a号紫草素和c号乙酰紫草素)混合溶液2的电泳指纹图谱；
图2是实施例六的不同产地或购买地的紫草的毛细管电泳指纹图谱；
其中，图中由上自下的为内蒙紫草对照药材3，其余新疆紫草药材购买自：云南昭通镇雄4、新疆伊宁5、成都荷花池6、新疆阿克苏7、河北安国8、新疆霍城9，新疆紫草对照药材10。
图3是试验例二的新疆紫草供试品采用不同种类ph缓冲液进行毛细管电泳的电泳指纹图谱；
其中，11采用磷酸缓冲液，12采用tris-hcl缓冲液，13采用硼酸盐缓冲液；
图4是试验例四的电泳运行缓冲液中添加sds和不添加sds的电泳指纹图谱；
其中，14为缓冲液中未添加sds，15为缓冲液中添加sds；
图5是试验例四的电泳运行缓冲液中含有不同浓度的sds的电泳指纹图谱；
其中，从上到下含有的sds浓度分别为35mmol·l-1(16)、30mmol·l-1(17)、25mmol·l-1(18)、20mmol·l-1(19)、15mmol·l-1(20)；
图6是试验例六新疆紫草供试液中不同背景溶液的电泳指纹图谱；
其中，21的新疆紫草供试液的背景溶液为运行缓冲液；22的新疆紫草供试液的背景溶液为无水乙醇；
图7是对比例一的试验组和对照组的电泳指纹图谱；
其中，23为试验组的电泳指纹图谱，24为对照组的电泳指纹图谱。
需要说明的是，这些附图和文字描述并不旨在以任何方式限制本发明的构思范围，而是通过参考特定实施例为本领域技术人员说明本发明的概念。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例一
1仪器与试剂
(1)仪器
p/acemdq型毛细管电泳仪(美国beckmancoulter公司)，配紫外检测器；未涂层熔融石英毛细管(内径为50μm，总长为50.2cm，有效长度为40.0cm，河北永年锐沣色谱器件有限公司)；xp205型电子分析天平(瑞士mettlertoledo公司)；ph计(sartoriuspb-10)；kq-500b型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。
(2)试剂
左旋紫草素shikonin：中国药品生物制品检定所，批号：110769-200405。乙酰紫草素acetylshikonin：上海源叶生物科技有限公司，批号：24502-78-1。硼酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)、硼砂(分析纯，北京化工厂)，无水乙醇(分析纯，北京化工厂)，十二烷基硫酸钠(sds，sigama)其他实验过程中所用化学试剂除特殊说明外，均为分析纯。实验用水为超纯水。所用溶液均经过0.22μm尼龙66膜过滤。
(3)药材
新疆紫草对照药材：北京北纳创联生物技术研究院，批号：160329。内蒙紫草对照药材：北京北纳创联生物技术研究院，批号：151208。
2方法
(1)制备新疆紫草的供试品溶液及对照品溶液；
供试品溶液的制备：
因新疆紫草中羟基萘醌色素极性较低，按药典紫外-可见分光光度法用乙醇溶解粗提样品，故本实验采用无水乙醇超声提取法制备供试品溶液。分别称取新疆紫草对照药材、紫草对照药材和其余7种药材2.00g，向其中加入无水乙醇30ml超声30min。减压抽滤，收集滤液后，再将滤渣按之前方法重新超声过滤。将两次滤液合并，旋蒸浓缩得到8ml新疆紫草粗提液，于4℃冰箱避光保存备用，实验前用ph＝8.0、100mmol·l-1硼酸盐缓冲溶液-25mmol·l-1sds-20％无水乙醇缓冲液定容至20ml，得0.05mg·ml-1供试品。
对照品溶液的制备：
精密称定左旋紫草素和乙酰紫草素各0.5mg，用运行缓冲溶液定容至5ml容量瓶，得0.1mg·l-1的对照品混合液，于4℃冰箱避光保存备用。
(2)毛细管电泳分析：分别吸取对照品溶液和供试品溶液适量，注入高效毛细管电泳仪中进行毛细管电泳分析，采用阳极加压进样和阴极在柱检测，记录毛细管电泳图谱40min。
电泳条件：毛细管柱用前依次用0.1mol·l-1naoh溶液、水、运行缓冲溶液分别冲洗10min，两次进样间用运行缓冲溶液分别冲洗5min，毛细管柱约隔4小时用0.1mol·l-1naoh溶液和水分别冲洗10min。系统控制与数据处理由32karat软件完成。
进样压力为3.45kpa；检测波长：214nm；进样时间：5s；分离电压：25kv；实验温度25℃。运行缓冲溶液是ph＝8.0、100mmol·l-1硼酸盐缓冲液-25mmol·l-1的sds-20％无水乙醇。
其中，ph＝8.0、100mmol·l-1硼酸盐缓冲液的配制方法为：精密称取硼酸0.8656g和硼砂0.5721g于干净的烧杯中，用超纯水溶解，然后转移至100ml容量瓶中定容，用ph计调至8.0。
3结果
如图1所示，新疆紫草供试品的毛细管电泳图谱中显示分离出6个清晰的特征峰，分离度良好，将各特征峰按照出峰时间依次命名为a峰、b峰、c峰、d峰、e峰、f峰。对照品中，具有两个特征峰a和c，a峰为左旋紫草素，c峰为乙酰紫草素。供试品的a峰与对照品a峰的出峰时间相同，c峰与对照品c峰的出峰时间相同，因此，供试品的a峰为左旋紫草素，c峰为乙酰紫草素。
实施例二-实施例五
实施例二到实施例五与实施例一的区别在于部分电泳条件不同，其它均与实施例一相同。
表1实施例二—实施例五的电泳条件
结果：实施例二和实施例三的电泳指纹图谱与实施例一类似，均得到6个特征峰，各峰之间的间距与实施例一相似，分离度较好。实施例四得到6个特征峰，但分离度稍差。实施例五也得到6个特征峰，各峰之间的间距较大，分离度较好，但所需分离时间稍长。
实施例六新疆紫草毛细管电泳指纹图谱的方法的应用
药材：新疆紫草对照药材：北京北纳创联生物技术研究院，批号：160329。内蒙紫草对照药材：北京北纳创联生物技术研究院，批号：151208。其余六种新疆紫草药材分别购自或产自：新疆霍城、河北安国、新疆阿克苏、新疆伊宁、成都荷花池、云南昭通镇雄。
本实施例的试剂、仪器、电泳条件、供试液和标准液制备方法均与实施例一相同。
将八种来自不同产地或购买地的紫草进行毛细管电泳分析，电泳图谱如图2所示，图中由上自下为内蒙紫草对照药材3、云南昭通镇雄4、新疆伊宁5、成都荷花池6、新疆阿克苏7、河北安国8、新疆霍城9、新疆紫草对照药材10。由图2可知，各样品供试液和对照液均得到了多个特征峰，且特征峰之间的分离度良好。
以新疆紫草标准品的峰面积为特征向量，各样品确立有6个共有峰，计算其他产地的供试品相对峰面积，结果见表2。
表2以新疆紫草峰面积为特征向量和其他供试品的相对峰面积
备注：“-”代表未检出
用夹角余弦值法即为比率定性相似度，结果见表3，评价不同来源的供试品与新疆紫草标准品的相似性。
表3相似度评价
鉴定标准：若样品与对照品的相似度大于等于0.9，说明样品为新疆紫草；若样品与对照品的相似度小于0.9，那么样品就不是新疆紫草。
由表2和表3可知，购自或产自新疆霍城、河北安国、新疆阿克苏、成都荷花池的紫草与新疆紫草对照品的相似度大于等于0.9，因此均为新疆紫草；购自或产自新疆伊宁、云南昭通镇雄的紫草、内蒙紫草对照品与新疆紫草对照品的相似度小于0.9，因此不是新疆紫草，购自或产自新疆伊宁、云南昭通镇雄的紫草更可能为其他类型紫草。
毛细管电泳条件的考察
试验例一到试验例七的仪器、试剂、药材、制备方法与实施例一相同。
试验例一检测波长的选择
将新疆紫草的供试样品利用紫外分光光度法进行检测，方法参考2015版《中国药典》。紫外光谱结果显示，分析样品在200～600nm范围内有两个明显的紫外吸收带，分别位于200～300nm和400～600nm之间。中国药典是以516nm为检测波长测定新疆紫草中羟基萘醌总色素的含量，限于紫外检测器的检测范围，本实验以常见的214nm为检测波长，在该检测波长下，将新疆紫草供试品进行毛细管电泳时，无明显溶剂峰出现，基线平稳，且信号峰明显。
试验例二ph缓冲溶液的选择
左旋紫草素的pka值为7.59，原则上ph＝pka±2的缓冲溶液可以作为候选的缓冲溶液。本试验例选择ph为8.0的磷酸缓冲液、tris-hcl缓冲液和硼酸盐缓冲液分别为毛细管电泳的运行缓冲液，然后分别对新疆紫草供试品溶液进行毛细管电泳，得到毛细管电泳图谱。
结果：如图3所示，由上至下分别是ph＝8.0的磷酸缓冲液(3)、tris-hcl缓冲液(4)和硼酸盐缓冲液(5)为毛细管电泳运行缓冲溶液时的电泳图。
从图3可以看出，在整个分离过程中，使用硼酸盐缓冲液和磷酸缓冲液的分离效果优于tris-hcl缓冲液，而硼酸盐缓冲液的分离效果又优于磷酸缓冲液。ph＝8.0的硼酸盐缓冲液作为运行缓冲液的电泳图中，得到的峰数目多，峰形明显，紫草素峰分离效果最好。同时考虑到硼酸盐缓冲液的缓冲范围(7.4～9.0)，硼酸盐缓冲液的缓冲范围更适合碱性物质的分离，因此采用硼酸盐缓冲液。
进一步的，本试验例考察了硼酸盐缓冲液对紫草提取液分离效果的影响。运行介质ph的变化会使提取物中某些组分的荷电情况发生改变，导致组分间的淌度发生变化，从而影响组分间的分离状况，进而表现出不同的分离度。
本试验例选择了ph＝7.4、ph＝8.0和ph＝9.0三种不同ph的硼酸盐缓冲溶液，对新疆紫草供试品溶液进行毛细管电泳。电泳结果显示，三种不同ph的硼酸盐缓冲溶液均能够得到多个特征峰，分离度有区别。其中，ph＝8.0和ph＝9.0的硼酸盐缓冲液作为运行缓冲液的电泳图得到的特征峰的数目多于ph＝7.4的硼酸盐缓冲液。ph＝8.0的硼酸缓冲液作为运行缓冲液的电泳图得到的峰数目较多，吸光度峰形明显优于ph＝7.4和ph＝9.0的峰形，且紫草素峰分离效果最好。ph＝9.0时，不再对组分的荷电情况产生影响，无法改善分离度。
因此，选择优先选择ph＝8.0的硼酸盐缓冲溶液作为缓冲液。
更进一步的，考察了ph＝8.0的硼酸盐缓冲液的浓度对对紫草提取液分离效果的影响。
本试验例选择了100mmol·l-1、150mmol·l-1和200mmol·l-1硼酸缓冲液对分离效果的影响。在不同浓度的硼酸缓冲液下，得到的电泳图谱得到了多个特征峰，但没有明显差别。
由于随着缓冲液浓度的增大，电泳过程中产生的焦耳热也越大。因此，150mmol·l-1和200mmol·l-1硼酸盐缓冲液会比100mmol·l-1硼酸盐缓冲液产生更多的焦耳热，还有可能影响分离效果。本着节约试剂的原则，选择100mmol·l-1硼酸盐缓冲液。
试验例三在ph＝8.0的缓冲液中添加不同有机改性剂对毛细管电泳的影响
本试验例考察了乙腈、乙醇两种有机改性剂对新疆紫草供试液毛细管电泳检测和分离的影响。结果发现当运行缓冲液中含有乙腈时，会严重导致基线不稳，各峰形重现性极差，而含乙醇时基线平稳，重现性良好。
进一步，本试验例考察了运行缓冲溶液中无水乙醇的不同体积分数(0～30％)对新疆紫草供试液毛细管电泳分离和检测的影响。检测结果如下：
未添加无水乙醇的运行缓冲液的分离度不好，基线也不稳定；添加了10％、35％的运行缓冲液的各组分峰面积及迁移时间重现性稍差。
表4运行缓冲溶液中不同体积分数无水乙醇的影响
因此，由上表可知，含20％无水乙醇的硼酸盐缓冲液(ph＝8.0)作为运行缓冲溶液，该体系下各组分峰面积及迁移时间重现性良好，基线明显改善，紫草素峰分离较好，且全部峰在35min内全部出现。
试验例四在运行缓冲液中添加sds对新疆紫草毛细管电泳结果的影响
运行缓冲溶液在不添加任何添加剂的情况下，电泳图的峰值低，重现性差。如图4所示，由上至下是运行缓冲液中添加了sds的电泳图和不添加sds的电泳图，结果表明，当溶液中含有sds时峰值比较大，基线平稳，峰数目多，各组分的分离度好，故在运行缓冲溶液中添加sds。
进一步地，在运行缓冲液中分别添加浓度为35、30、25、20、15mmol·l-1的sds，对新疆紫草供试液进行毛细管电泳检测。
毛细管电泳结果如图5所示，由上至下sds的浓度分别为35、30、25、20、15mmol·l-1，从图中可以看出sds浓度越高，新疆紫草供试液的电泳图谱的各组分的分离度越好，同时，各特征峰出现的时间也延长。其中，使用含有浓度为20、25、30、35mmol·l-1sds的运行缓冲液，电泳图的分离度较好，特征峰较明显；含15mmol·l-1的sds的运行缓冲液的电泳，图谱的分离度较差。这是因为微乳液滴的稳定性增加，运行缓冲溶液对疏水性组分的增溶能力也增强，因此对脂溶性组分的分离能力增强。
使用含有浓度为25、30、35mmol·l-1sds的运行缓冲液，电泳图的分离度良好，且差别不大，但使用含有浓度为30、35mmol·l-1sds的运行缓冲液的电泳图的分离时间更长。这是由于离子强度的增大的同时使得电泳电流增大，发热增强导致噪音增大，导致分离时间的延长。
因此综合考虑电泳图的分离度和样品的检测时间，在毛细管电泳中，选择使用含有浓度为25mmol·l-1sds的运行缓冲液进行电泳的分离度和分离时间最为理想。
试验例四分离电压的选择
本试验例分别以13、16、20、22、25kv作为分离电压，考察分离电压对分离效果的影响。结果表明，分离电压为13～25kv，均能够得到多个特征峰，随着电压的升高，分离度越好，分离电压为20～25kv的分离度优于分离电压为13kv、16kv的分离度。分离电压为25kv时，分离度最好，可以明显提高柱效，缩短分离时间，基线平稳。因此最优选方案的分离电压为25kv。
试验例五进样量的影响
本试验例考察了进样时间分别为3s、5s的进样量对分离检测的影响，进样压力均为3.45kpa。当压力进样3s时，紫草素峰信号响应值低，重现性不好。进样3s时出现的峰没有进样5s时出现信号峰的数目多，且进样5s时吸光度峰形更加明显，紫草素峰形对称，因此选择进样5s为佳。
试验例六新疆紫草供试品背景溶液的影响
新疆紫草的供试品溶液采用不同背景溶液溶解时，对电泳的基线产生不同影响，也会影响电泳的整体效果。背景溶液也就是溶解供试品的溶液。一般对新疆紫草的粗提液采用无水乙醇定容，则背景溶液为无水乙醇；本试验例为尽量减小供试品背景溶液对电泳的影响，采用了电泳的运行缓冲液对新疆紫草的粗提液进行溶解定容，背景溶液为运行缓冲液；并对这两种供试品进行了毛细管电泳。
结果如图6所示，用运行缓冲溶液制备的供试品所得电泳图基线较为平稳，重现性良好，各峰的分离度较高，如电泳指纹图谱21。用无水乙醇制备的供试品所得电泳图基线不稳，重现性较差，如电泳指纹图谱22，故优化为用运行缓冲溶液制备供试品。
经过对各项电泳条件的筛选，得到较优选的电泳条件，即实施例一到实施例三的电泳条件，因此，基于hpce建立了的新疆紫草指纹图谱的方法，下面对该指纹图谱的方法进行了方法学考察。对建立的化学指纹图谱的专属性、精密度、重现性、稳定性等进行了相应研究，结果表明本方法符合指纹图谱的技术要求。
试验例七方法学考察
1、专属性试验
取紫草素和乙酰紫草素对照品混合溶液、新疆紫草标准品供试液，分别在毛细管电泳仪上进行检测，电泳结果与图1类似，这里不再展示。
对照品溶液中各组分间均实现了基线分离，基线分离是指两个峰之间的谷值已经回到基线水平，即两个峰完全分离。各组分间均实现了基线分离证明毛细管电泳方法具有良好的专属性。在供试液中加入对照品溶液，进样分析，电泳的特征峰的增益结果确定了紫草素(a号峰)和乙酰紫草素(c号峰)的出峰顺序和保留时间。紫草素是新疆紫草的特有有效成分，紫草素峰形对称，且与相邻峰分离良好，计算紫草素峰的理论塔板数为21154，因此选择紫草素峰作为新疆紫草指纹图谱的参照峰(s)。
2、稳定性试验
取同一批次的新疆紫草标准品和供试品，室温密闭保存，分别在0，2，4，8，12h进行检测，测得各共有峰相对保留时间的rsd小于5.0％，单峰面积大于或等于10％总峰面积的色谱峰的相对峰面积的rsd小于5.0％，表明该方法具有良好的稳定性，考察结果见表5。
表5新疆紫草供试品毛细管电泳的稳定性考察结果
由表5可知，各峰相对保留时间的rsd均小于5.0％，相对峰面积的rsd也均小于5.0％，说明稳定性好。
3、精密度实验
取同一批次的新疆紫草粗提液连续进样5次，其共有峰相对保留时间的rsd小于5.0％，单峰面积大于或等于10％总峰面积的色谱峰的相对峰面积的rsd小于5.0％，表明该方法具有较好的重复性，考察结果见表6。
表6新疆紫草供试品毛细管电泳的精密度考察结果
由表6可知，连续五次进样后，各次的共有峰相对保留时间的rsd均小于5.0％，相对峰面积的rsd也均小于5.0％，说明该方法重复性好。
4、重现性实验
取同一批次的新疆紫草药材，同法制备5份供试品溶液进行毛细管电泳检测。结果如表7所示，5份新疆紫草的供试品溶液毛细管电泳的共有峰相对保留时间的rsd小于5.0％，单峰面积大于或等于10％总峰面积的色谱峰的相对峰面积的rsd小于5.0％，表明该方法具有较好的重现性，考察结果见表7。
表7新疆紫草供试品毛细管电泳的重现性考察结果
对比例一
对比例一的仪器、试剂、药材、制备方法与实施例一相同。
试验组：电泳条件与实施例一相同；
对照组：电泳条件与文章“毛细管电泳分离法检测新疆紫草中萘醌类成分”中最优方案相同。实验条件为检测波长200nm，运行缓冲液为含20％乙醇的硼酸盐缓冲液(0.1mol·l-1，ph＝8.0)，进样量3.45kpa×5s，分离电压20kv。
实验结果如图7所示。从图7的电泳图可知，试验组(23)的组分的特征峰数目多，各组分的特征峰的分离度明显优于对照组(24)，且对照组(24)的紫草素(约15min处的峰)的分离效果较差。因此，实施例一的电泳条件更适于紫草提取物各成分的分离，建立指纹图谱。
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。