本发明属于生物检测
技术领域：
，具体涉及一种基于新型SERS基底定量检测致病菌的方法。
背景技术：
：近年来，微生物引起的食源性疾病已经成为当今世界性公共卫生热点。在食源性致病菌中，大肠杆菌(Escherichiacoli)O157:H7是最危险的一个，也是目前世界上公认的三大最主要的食源性致病菌之一。感染大肠杆菌O157:H7的临床症状包括腹泻、出血性肠炎(HC)、溶血性尿毒综合征(HUS)和血栓形成的血小板减少性紫癜等。致病性大肠杆菌可通过污染饮水、食品等途径引起疾病暴发流行，严重危害人体健康。目前检测大肠杆菌O157:H7的金标准是传统分离鉴定法，该方法需经过预增菌、选择性增菌、分离培养、生理生化鉴定及血清型鉴定等步骤，整个过程繁琐耗时(3～7天)，且整个过程需要专业人员操作，因此该方法只能用于执法部门对中毒事件的起因进行分析，以及对市场食品安全状况进行评估；免疫学尤其是免疫层析方法，不需复杂仪器设备，检测时间较快易操作，但目前该类方法总体检测灵敏度偏低(细菌浓度需达到105～106CFU/mL)，因此针对真实样品检测，往往需要较长的增菌时间。因此，建立快速、灵敏、稳定的检测方法对食源性致病菌的检测具有重要的意义。表面增强拉曼散射(Surface-enhancedRamanscattering，SERS)标记技术是一种新颖的光谱标记方法，他利用金、银等贵重金属的纳米粒子来增强吸附在其表面的标记分子的拉曼信号，并将其作为标记示踪信号。SERS标记技术具有如下的优点，拉曼光谱谱峰窄、拉曼散射几乎不受水的影响、SERS信号强、低背景、基本不受光漂白的影响且不易发生淬灭现象、具有超高的灵敏性和选择性等。基于SERS技术而发展起来的纳米探针在生物成像、蛋白质检测、肿瘤识别等诸多领域展现出可观的应用前景。技术实现要素：为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种基于新型SERS基底定量检测致病菌的方法。本发明采用二氧化硅包裹金纳米微球集成免疫磁珠捕获技术快速定量检测致病菌(如：大肠杆菌O157:H7(E.coliO157:H7))。本发明的方法具有稳定性好、灵敏度高、特异性强、检测过程简单快速、准确定量等特点。本发明的目的通过下述技术方案实现：一种基于新型SERS基底定量检测致病菌的方法，包括如下步骤：(1)将拉曼信号分子结合到金纳米颗粒表面，随后通过氨水还原正硅酸乙酯(TEOS)的方法在结合了拉曼信号分子的金纳米颗粒表面形成二氧化硅薄层，以保证拉曼信号分子的稳定性；(2)通过硅烷偶联剂将巯基修饰在步骤(1)中制备好的硅层上，再通过中间体将致病菌抗体修饰在该颗粒表面，用牛血清蛋白(BSA)封闭剩余活性位点，制备成拉曼信号探针；(3)采用活化剂活化表面修饰有羧基的磁珠，随后加入致病菌抗体和BSA制备成磁性纳米颗粒，即捕获探针；(4)将培养好的致病菌离心后用水重悬，并稀释成一组具有浓度梯度的标准样品液；(5)取相同体积的步骤(3)中的捕获探针，分别加入步骤(4)不同浓度的标准样品液，室温中孵育，磁分离后去掉上清液；再将步骤(2)中的拉曼信号探针加入，形成“捕获探针-致病菌-信号探针”的“三明治”结构；磁分离后，对上清液中剩余的拉曼信号探针进行信号采集；(6)根据致病菌浓度与拉曼信号强度的对应关系建立标准曲线，从而应用拉曼信号对致病菌进行定量检测；在上述检测致病菌的方法中：所述的致病菌优选为大肠杆菌(E.coli)O157:H7；步骤(2)、(3)中所述的致病菌抗体优选为大肠杆菌(E.coli)O157:H7抗体；步骤(1)中所述的拉曼信号分子优选为4,4′-联吡啶，该分子一端连接在胶体金表面，另一端与抗体相连，是双官能团标记分子；步骤(1)中所述的金纳米颗粒的平均粒径优选为25nm～35nm；优选为30nm；步骤(1)中所述的氨水还原正硅酸乙酯的方法是在异丙醇的水溶液中进行；步骤(2)中所述的硅烷偶联剂是(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷(MPTMS)，通过偶联作用将巯基修饰在硅层上；步骤(2)中所述的中间体是3-硫代-N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸钠盐(sulfo-SMCC)，其中一端马来酰亚胺接在硅层的巯基上，另一端琥珀酰亚胺用来连接致病菌抗体；步骤(2)中所述的致病菌抗体的浓度优选为0.5～1mg/mL；更优选为0.5mg/mL。步骤(2)中所述的牛血清蛋白(BSA)为质量百分数2.5％的BSA，与重悬用的0.002mol/L硼酸盐缓冲溶液(BB)(pH＝8.2)的体积比优选为1：50；步骤(3)中所述的表面修饰有羧基的磁珠，其粒径优选为100～200nm；优选为表面修饰有羧基的四氧化三铁；步骤(3)中所述的活化剂优选为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)；步骤(4)中所述的致病菌培养过程如下：首先将冻存的菌种放置在37℃的环境中活化30min，然后把活化好的菌种加入到已灭菌的LB培养基中，放置在恒温培养箱中(120rpm，37℃)振荡10h；步骤(4)中所述的浓度梯度为0、10、103、105、107、109CFU/mL，其中0CFU/mL为空白对照；步骤(5)中所述的室温中孵育的时间优选为1～2h；更优选为1h；步骤(5)中所述的“三明治”结构(捕获探针-致病菌-信号探针)的混合体积比例为3.5～4.5：1：4.5～5.5；优选为4：1：5；当采用该比例的用量关系时，最低检测限和背景信号大小合适；步骤(5)中所述的磁分离是指利用磁场物理作用分离磁性结合物与上清液，相比于传统的清洗固相基底来去除残留物的步骤，此方法更加渐变、高效；步骤(5)中所述的信号是通过显微拉曼光谱仪测得：所述的显微拉曼光谱仪的操作条件优选为激发光源是波长为632.8nm的He-Ne激光器，到达样品的激光功率为1mW，信号收集时间为10～60s；步骤(5)中所述的信号是选取拉曼信号分子的特征拉曼谱峰(1612cm-1)作为定量峰，并以致病菌浓度对该谱峰光谱强度作图，并以此绘制标准曲线；本发明的机理：在收集时间一定的情况下，对于同一种拉曼信号分子，信号强度与拉曼信号分子的浓度呈正相关；正是在此基础上实现了定量检测。本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：(1)本发明将免疫光谱标记处理的二氧化硅包裹金纳米颗粒用于致病菌(如：E.coliO157:H7)的定量检测，将拉曼分子的信号强度和待测物质的浓度联系起来，类似于朗伯比尔定律，从而实现对致病菌(如：E.coliO157:H7)的定量检测；(2)本发明采用的二氧化硅包裹金纳米颗粒是新型拉曼基底，并首次将4,4′-联吡啶包裹在硅层内，以保证拉曼信号分子在后续反应中的稳定性；(3)本发明基于二氧化硅包裹金纳米颗粒制备的免疫信号探针，相比于传统的裸金探针，稳定性得到了大大提升，可以在4℃条件下稳定保存至少50h；(4)本发明无需将致病菌(如：E.coliO157:H7)从免疫磁珠上洗脱下来，提高了捕获效率，定量检测时变异系数小；减少了工作量和杂菌污染概率；(5)本发明是通过检测溶液的拉曼光谱信号得到相应的结果，相比于传统的检测固相基底的方法，溶液中的拉曼光谱信号监测数据更加稳定可靠且可大量重复；(6)本发明检测稳定性好，检测灵敏度高，得到了一个宽的检测区间(10～109CFU/mL)和低的检测限(10CFU/mL)；(7)本发明操作简单，SERS免疫信号探针与捕获探针都可以提前准备好，操作时只需将捕获探针和信号探针依次加入到待测样品中反应，反应结束后通过磁分离可以马上进行检测：收集时间30s，然后立刻从标准曲线上读出浓度，从而实现快速定量检测；这可以满足食品安全和环境监测部门的要求，具有广泛的实用性。附图说明图1是快速定量检测E.coliO157:H7的方法流程示意图。图2是制备的金纳米颗粒和二氧化硅包裹金纳米颗粒的透射电镜图。图3是使用不同浓度E.coliO157:H7标准溶液得到的拉曼信号光谱图。图4是标准溶液中E.coliO157:H7检测的曲线图；其中，横坐标代表E.coliO157:H7的浓度(横坐标是浓度的log10)，纵坐标代表水体中E.coliO157:H7的拉曼信号强度。图5是基于二氧化硅包裹金纳米颗粒制备的信号探针和基于裸金制备的信号探针稳定性的对比。图6是E.coliO157:H7特异性检测的拉曼信号强度图。具体实施方式下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下面实施例中，未注明具体条件和环境的实验方法，通常按照常规条件，或制造厂商所建议的条件。本发明中DP为拉曼信号分子4,4′-联吡啶；BSA为牛血清蛋白；BB表示硼酸盐缓冲液；PBS表示磷酸盐缓冲液；EDC表示1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚氨盐酸盐；NHS表示N-羟基琥珀酰亚胺；APTES表示3-氨丙基三乙氧基硅烷；TEOS表示正硅酸乙酯；MPTMS表示(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷；Sulfo-SMCC表示3-硫代-N-琥珀酰亚胺基4-(马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸钠盐。快速定量检测E.coliO157:H7的方法流程示意图，如图1所示。实施例1(1)、金纳米颗粒的制备在不断搅拌下将100mL1mM的氯金酸(HAuCl4)溶液加热至沸腾，然后加入6mL38.8mM的柠檬酸三钠水溶液。此时溶液的颜色变化是：淡黄-无色-黑色-紫色-深红色，等溶液变成深红色继续加热回流15～20min。最后冷却至常温，制备得到30nm的金纳米颗粒(如图2C)，图2A是理想条件下得到的金纳米颗粒。(2)、二氧化硅包裹金纳米颗粒的制备向6个1.5mLEP管中分别加入1mL金纳米颗粒(浓度约为1mmol/L)，然后依次加入30μL0.01mM的4,4′-联吡啶溶液，充分混匀后反应10min，8000rpm离心10min，去除上清液，分别用1mL三蒸水重悬。然后将6个EP管中的胶体全部转移至25mL血清瓶中，在不断搅拌下依次向血清瓶中加入10μL2.7％NaSiO3溶液(反应10min)(购自Sigma试剂公司)和12μL1mMAPTES溶液(反应10min)(购自Sigma试剂公司)，反应结束后分置在6个EP管中，8000rpm离心10min，去除上清液，三蒸水重悬；再将6个EP管中的混合液逐滴加入到6mL异丙醇水溶液中(3mL异丙醇+3mL三蒸水)，搅拌5min后，加入200μL氨水(混合5min)(购自Sigma试剂公司)，最后将300μLTEOS(购自Sigma试剂公司)逐滴加入到上述混合液中，搅拌反应3h，反应结束；6000rpm离心15min，三蒸水重悬，最后得到二氧化硅包裹的金纳米颗粒(如图2D)，图2B是理想条件下合成的二氧化硅包裹的金纳米颗粒。(3)、拉曼信号探针的制备向1mL二氧化硅包裹的金纳米颗粒中加入6μL0.1mMMPTMS(购自Sigma试剂公司)，充分混匀反应30min，然后利用离心机离心15min，转速为6000rpm。离心后去掉上清液，以1mLBB缓冲液重悬；随后加入3μL0.1mMSulfo-SMCC，反应30min后，加入5μL0.5mg/mLrabbitanti-E.coliO157:H7(即E.coliO157:H7抗体)(购自北京博奥森生物技术有限公司)，室温下孵育2h，以8000rpm离心10min，去掉上清液，用BB缓冲液重悬；最后加入30μL2.5％BSA，反应1h，离心(8000rpm，10min)去上清液，用PBS缓冲液重悬备用，最终得到的信号探针保存在4℃环境下。(4)、捕获探针的制备取100μL表面修饰有羧基的四氧化三铁Fe3O4，购自阿拉丁试剂(上海)有限公司，用PBS清洗两次，最后用PBS定容至1mL。然后配制EDC(4mg/mL)和NHS(1mg/mL)，首先向上述磁珠溶液加入30μL的EDC溶液，10min后加入同样体积的NHS溶液，活化30min。然后用PBS清洗磁珠两次，之后用PBS重悬，随后加入5μL0.5mg/mLrabbitanti-E.coliO157:H7，反应2h后用PBS洗涤去除多余抗体，加入30μL的BSA(2.5％)，封闭未结合的位点。1h后，用PBS清洗上述磁珠两次，重悬备用，得到捕获探针。(5)、标准样品溶液的制备选择6个浓度的E.coliO157:H7标准溶液，分别为0、10、103、105、107、109CFU/mL，其中0CFU/mL为空白对照。(6)、“三明治”结构制备以及E.coliO157:H7的检测取80μL步骤(4)中制备的捕获探针和20μL步骤(5)中配制好的标准样品溶液混合1h，利用捕获探针上的抗体与大肠杆菌特异性结合，形成“捕获探针-大肠杆菌”的两层结构；随后再加入100μL步骤(3)中制备的拉曼信号探针，反应2h后，形成了“捕获探针-大肠杆菌-信号探针”的“三明治”结构；随着E.coliO157:H7浓度的增加，“三明治”结构会有不同程度的增加，磁分离后的上清液中残留的拉曼信号探针浓度也会有不同程度的减少。(7)、拉曼信号的测量利用磁铁的磁场作用分离底物，保留上清液。用日本NipponOpticalSystem公司的显微拉曼光谱仪，对上清液中的拉曼信号探针进行信号采集，激发光源是波长为632.8nm的He-Ne激光器，到达样品的激光功率为1mW，信号收集时间为30s。信号采集完毕后通过Origin软件对数据进行基线处理，得到清晰直观的SERS光谱图(如图3)。从图4中可以明显地看到，随着样品中E.coliO157:H7浓度的提高，采集的SERS信号逐渐降低，两者关系符合Y＝1489.24-80.74X，表明在这一区间可以进行有效的定量分析。实施例2取1mL制得的金纳米颗粒溶液，放入EP管中，加入30μL0.01mM的4,4′-联吡啶溶液，室温反应10min后，8000rpm离心(10min)，去除上清液，用BB缓冲液重悬，加入5μL0.5mg/mLrabbitanti-E.coliO157:H7，孵育2h后，离心(8000rpm，10min)去上清液，BB缓冲液重悬，再加入30μL2.5％BSA，封闭未结合位点，1h后离心(8000rpm，10min)去上清液，用PBS缓冲液重悬，制备得到裸金的信号探针。将其与实施例1步骤(3)中的信号探针放置相同时间，并测得各自在同一时间的拉曼信号强度(如图5)。从图5中得知，初步的研究表明这种新型的SERS基底具有如下优势：1)二氧化硅硅层可以保证金纳米颗粒不受外界化学条件的干扰；2)把4,4′-联吡啶包裹在硅层内可以防止标记分子在后续反应中发生脱落；3)二氧化硅硅层可以阻止抗体与标记分子发生竞争反应。实施例3取珠江广州段的水体样品，经过过滤、离心，并用三蒸水稀释40倍以消除基质影响(该已知浓度的水体稀释液中E.coliO157:H7的浓度分别为102、104、106、108CFU/mL)。根据该实际水体样品中获得的拉曼光谱信号强度，从图4中的标准曲线读出对应的E.coliO157:H7的浓度，乘以相应的稀释倍数即为待测样品中E.coliO157:H7的实际浓度。根据实施例1中的线性方程得出的实际水体样品的浓度如下表1中所示。表1实际水体样品中E.coliO157:H7浓度和采用本实施例方法测得的E.coliO157:H7浓度已知浓度(CFU/mL)实测浓度(CFU/mL)回收率(％)相对标准偏差(％)1×1021×102.06114.823.771×1041×103.9793.334.541×1061×106.01102.3312.941×1081×108.07117.493.69实施例4为了说明本发明的特异性，分别制备了来自广州市疾病预防控制中心的大肠杆菌137(E.137)，大肠杆菌108G(E.108G)，大肠杆菌974(E.974)，大肠杆菌1006(E.1006)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)(SA)，沙门氏菌(Salmonellaenteriditis)(SE)，李斯特菌(Listeriamonocytogenes)(Lm)标准溶液，具体实施步骤参照例1；得到的信号强度可参照图6，说明本发明具有很强的特异性。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 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