一种金属铽荧光探针检测肾上腺素的方法及其用途与流程

本发明涉及药物分析和生物分析技术领域，具体涉及一种金属铽荧光探针检测肾上腺素的方法及其用途。

背景技术：

肾上腺素(E)是哺乳动物(含人类)中枢神经系统重要的神经传递物质，属于自然产生的儿茶酚胺类物质之一，它在机体内的浓度大小影响多种生理过程，其代谢的紊乱可导致某些疾病的发生。肾上腺素盐酸盐药物在医学上常用来治疗急性心力衰竭、过敏性休克、哮喘、鼻充血、低血压等疾病。肾上腺素是第一个获得结晶形式的激素。由于肾上腺素具有邻苯二酚结构，所以有较强的还原性，在空气或水溶液中易被氧化，稳定性差。在人体内，肾上腺素经由下列一系列生化反应过程形成：酪氨酸→多巴→多巴胺→去甲肾上腺素→肾上腺素(Mohammad,M.K.,M.A.Seikh.and H.L.Sang.Spectrofluorimetric Estimation of Norepinephrine Using Ethylenediamine Condensation Method.J.fluoresce.2007,17(3):427–436.)。因此，研究其测定方法尤其是微量肾上腺素的测定方法对生理机能和临床医学研究具有重要的实际意义。

目前测定肾上腺素的方法主要有高效液相色谱法，电化学法，荧光法和化学发光法等。高效液相色谱法对样品前处理要求较高，检测速度较慢，技术难度高，对实际生物样品的检测有一定的局限性。电化学分析法目前报道较多的是化学修饰电极法，该方法测定生物样品，稳定性较差且修饰电极的电极使用寿命较短，方法有待进一步完善。荧光法具有操作简便、灵敏度高、低成本等特点，在肾上腺素等药物的测定中具有独特的优越性。

技术实现要素：

本发明的目的是克服高效液相色谱法对样品前处理要求较高，检测速度较慢，技术难度高等缺点，提供一种金属铽荧光探针检测肾上腺素的方法及其用途，本发明中，Tb(III)与乙二胺四乙酸二钠盐(EDTA)形成络合物，加入肾上腺素作为协同配体，可形成稳定的三元络合物Tb(III)―EDTA―E，该三元络合物能发射出Tb(III)的特征荧光。在此三元络合物体系中加入阴离子表面活性剂十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)作为增敏剂，能显著增加三元络合物的荧光强度，在302nm激发波长下，三元络合物在545nm处发射出铽的特征荧光；与不加增敏剂的体系相比，加入增敏剂后三元络合物的荧光强度增大了4倍多。据此建立了肾上腺素的检测方法，该方法灵敏度高，操作简单，检出限低。

根据本发明的第一个方面，本发明提供了一种金属铽荧光探针检测肾上腺素的方法，包括以下步骤：

1)在10mL的比色管中，依次分别加入肾上腺素水溶液、Tb(III)-EDTA水溶液、NaOH水溶液和十六烷基三甲基氯化铵水溶液，用水稀释到刻度，摇匀，静置20min使其充分反应得供试品溶液；

2)反应完毕后取供试品溶液，置于1cm比色皿，在激发波长302nm，发射波长545nm处测定体系的荧光强度I值，同时测定试剂空白的荧光强度I₀值；

供试品溶液中肾上腺素测量的相对荧光强度定义为△I，其中△I＝I–I₀；

所述试剂空白I₀值的测定除不加肾上腺素外，其余步骤同步骤1)；

所述Tb(III)-EDTA水溶液由等摩尔的Na₂EDTA或其水合物与TbCl₃或其水合物在无机碱的水溶液中制备而成。

所述供试品溶液中Tb(III)-EDTA浓度为1.0×10^-3mol/L，NaOH浓度为0.01mol/L。

所述供试品溶液中十六烷基三甲基氯化铵浓度为2.0×10^-4mol/L。

本发明肾上腺素浓度在7.0×10^-8～5.0×10^-5mol/L范围内，体系的相对荧光强度△I(△I＝I–I₀)与肾上腺素的浓度成正比。线性回归方程为△I＝16.78×10^-4C+7.36，式中C为肾上腺素浓度(mol/L)，根据线性回归方程可计算出任意荧光强度所对应的肾上腺素的浓度。

根据本发明的另一个方面，本发明金属铽荧光探针检测肾上腺素的方法的可用于检测肾上腺素含量。

含量的具体检测方法包括以下步骤：

1)绘制标准工作曲线

取若干支10mL比色管，按照上述的金属铽荧光探针检测肾上腺素的方法制备不同浓度的系列肾上腺素标准溶液，测定体系的相对荧光强度△I，以不同的肾上腺素浓度与对应的相对荧光强度△I作图，绘制标准工作曲线得线性回归方程；所述肾上腺素标准溶液浓度为7.0×10-8～5.0×10-5mol/L；

2)测定样品中肾上腺素浓度

向比色管中加入肾上腺素样品溶液，测定其相对荧光强度，根据标准工作曲线确定样品中肾上腺素的含量；或者根据线性回归方程计算样品中肾上腺素的含量。

所述检测方法可以排除常见金属离子和药物赋形剂的干扰，检出限可达到2.1×10^-8mol/L；所述常见金属离子和药物赋形剂包括Na⁺(500),K⁺(500),Cl^-(500),NO₃^-(500),Ca²⁺(100),SO₃^2-(100),Mg²⁺(50),SO₄^2-(50),Zn²⁺(25),Mn²⁺(25),PO₄^3-(25),Fe³⁺(5),焦亚硫酸钠(100)，对苯二酚(100)，胱氨酸(100)，普鲁卡因(50)，淀粉(50)，葡萄糖(25)，果糖(5)，括号中的数据为干扰离子浓度和肾上腺素浓度之比(C_E＝5.0×10^-6mol/L)；在干扰物质存在下，与不加干扰物质相比，以体系荧光强度变化不超过±5％为标准确定是否有干扰。

本发明的有益效果是：

(1)本方法不需要合成新材料，通过增敏剂对铽三元络合物的增敏作用，实现对肾上腺素的高灵敏荧光检测。

(2)对肾上腺素浓度的检测范围广，当肾上腺素浓度在7.0×10^-8-5.0×10^-5mol/L范围时，络合物的相对荧光强度△I与肾上腺素的浓度成正比。

(3)提高了测定对象的稳定性，方便测定操作。由于形成的三元络合物具有较高的稳定性，可有效防止肾上腺素被空气中的氧氧化，形成的三元络合物溶液其荧光强度能稳定6小时以上，比其它方法测定肾上腺素时溶液的稳定性有很大提高。

(4)可实现简便、快速和灵敏的检测，检出限低。

(5)本方法可以为高效液相色谱和毛细管电泳等方法提供一种快速、有效的检测方法。

本发明中Tb(III)―EDTA是指Na₂EDTA与TbCl₃形成的二元络合物；

本发明中Tb(III)―EDTA―E是指Na₂EDTA与TbCl₃和肾上腺素形成的三元络合物；

本发明中Tb(III)―EDTA―E―CTAC是指Tb(III)―EDTA―E在增敏剂十六烷基三甲基氯化铵(Hexadecyltrimethylammonium chloride，简写为CTAC)存在下形成的络合体系。

附图说明

图1为肾上腺素、EDTA和铽离子形成三元络合物的结构式。

图2为荧光激发光谱。图中曲线(1)为Tb(III)―EDTA二元络合物、曲线(2)为Tb(III)―EDTA―E三元络合物、曲线(3)为Tb(III)―EDTA―E―CTAC三元络合物在增敏剂中的荧光激发光谱。

图3为荧光发射光谱。图中曲线(1)为Tb(III)―EDTA二元络合物的荧光光谱；曲线(2)为Tb(III)―EDTA―E三元络合物的荧光光谱；曲线(3)为Tb(III)―EDTA―E―CTAC三元络合物在增敏剂中的荧光光谱。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面结合具体实施方式，对本发明进一步详细说明。应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。

实施例1

肾上腺素三元络合物的荧光检测

1.溶液配制

(1)Tb(III)-EDTA储备溶液(0.05mol/L)：准确称取1.8612g Na₂EDTA·2H₂O于100mL烧杯中，加入2mL0.1mol/L NaOH，加水溶解后加入1.5966g TbCl₃·2H₂O，溶解后转移至100mL容量瓶稀释至刻度定容。使用时根据所需浓度逐级稀释。

(2)肾上腺素储备溶液(1.0×10^-3mol/L)：准确称取0.0183g肾上腺素标准品(南京药检所)于50mL烧杯中，加入5mL0.1mol/L HCl，溶解后加少量水和1mL 4.0×10^-3mol/L Na₂SO₃，然后转移至100mL容量瓶稀释至刻度定容，保存在冰箱中。使用时根据所需浓度逐级稀释。

2.荧光测定

取三支10mL的比色管，分别按如下步骤加入溶液：

第一支比色管中加入1mL 1.0×10^-2mol/L Tb(III)―EDTA溶液和1mL 0.1mol/L NaOH溶液，稀释到刻度；

第二支比色管中依次加入1mL 5.0×10^-5mol/L肾上腺素溶液、1mL 1.0×10^-2mol/L Tb(III)―EDTA溶液和1mL0.1mol/L NaOH溶液，稀释到刻度；

第三支比色管中依次分别加入1mL 5.0×10^-5mol/L肾上腺素溶液、1mL 1.0×10^-2mol/L Tb(III)―EDTA溶液、1mL 0.1mol/L NaOH溶液和2mL 1.0×10^-3mol/L CTAC，稀释到刻度；

以上各溶液摇匀，静置20min后，用1cm比色皿测定其荧光光谱。图2为测得的荧光激发光谱，由图可知，三元络合物在300nm处出现较强的激发峰，加入增敏剂后发生轻微红移在302nm处出现很强的激发峰，而二元络合物在此范围内没有出现任何峰。图3为荧光发射光谱，由图可知，三元络合物在545nm处出现了铽的特征发射峰，加入增敏剂后荧光强度有显著的增强，而二元络合物几乎观察不到铽的特征荧光峰。

实施例2

实验条件的优化，建立测定肾上腺素的荧光分析法

(1)溶液酸度优化

溶液酸度是形成三元络合物的关键因素，溶液酸度的优化按照以下步骤：

在9支10mL的比色管中，依次分别加入1mL 5.0×10^-5mol/L肾上腺素溶液、1mL 1.0×10^-2mol/L Tb(III)―EDTA溶液、一定量的Tris缓冲溶液并用稀盐酸和氢氧化钠调节至下列所需pH值：9,9.5,10,10.5,11,11.5,12,12.5,13，最后再分别加入2mL 1.0×10^-3mol/L CTAC，稀释到刻度；制备成pH值分别为9,9.5,10,10.5,11,11.5,12,12.5,13不同酸度的络合物溶液，然后用1cm比色皿，在激发波长为302nm，发射波长为545nm处测量体系荧光强度。最大荧光强度对应的酸度为pH＝12～13，实验中选择pH＝12为最佳酸度。

pH＝12条件下对不同种类缓冲溶液进行了实验，例如Tris,NH₄Cl-NH₃,Na₂CO₃-NaHCO₃,硼酸盐，NaOH等，其中以NaOH效果最好，后续实验选择用NaOH溶液调节酸度。

(2)Tb(III)―EDTA溶液浓度优化

Tb(III)―EDTA溶液浓度优化步骤如下：在8支10mL的比色管中，依次分别加入1mL5.0×10^-5mol/L肾上腺素溶液、不同浓度的Tb(III)―EDTA溶液(浓度分别为0.1,0.3,0.5,1.0,2.0,3.0,4.0,5.0(×10^-3mol/L))、1mL0.1mol/L NaOH溶液和2mL1.0×10^-3mol/L CTAC，稀释到刻度测定荧光强度；当Tb(III)―EDTA溶液浓度大于0.5×10^-3mol/L体系荧光强度较强并基本保持恒定，实验中选择1.0×10^-3mol/L为Tb(III)―EDTA溶液最佳浓度。

(3)表面活性剂优化

表面活性剂优化步骤如下：在9支10mL的比色管中，依次分别加入1mL 5.0×10^-5mol/L肾上腺素溶液、1mL 1.0×10^-2mol/L Tb(III)―EDTA溶液、1mL 0.1mol/L NaOH溶液，最后再分别加入2mL 1.0×10^-3mol/L的不同表面活性剂(例如：十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)，溴化十六烷基吡啶(CPB)，十二烷基硫酸钠(SDS)，十二烷基苯磺酸钠(SDBS)等)，稀释至刻度测定荧光强度；根据优化结果，最后选择CTAC为增敏剂，浓度优化结果其最佳浓度为2.0×10^-4mol/L。

(4)测定肾上腺素的标准曲线及检出限

按照上述表面活性剂优化步骤，表面活性剂采用CTAC和其最佳浓度，配制一系列肾上腺素浓度在7.0×10^-8-5.0×10^-5mol/L范围内的溶液，溶液由肾上腺素储备液(1.0×10^-3mol/L)经稀释得到。平行测定三次(n＝3)，以肾上腺素浓度为横坐标，相对荧光强度△I为纵坐标绘图，得到测定肾上腺素的标准曲线为△I＝16.78×10^-4C+7.36，式中C为肾上腺素浓度(mol/L)，相关系数为0.9992，经计算得方法的检出限为2.1×10^-8mol/L。

实施例3

肾上腺素测定的选择性

在10mL的比色管中按如下步骤加入溶液：1mL 5.0×10^-5mol/L肾上腺素标准溶液、1mL 1.0×10^-2mol/L Tb(III)―EDTA溶液、1mL0.1mol/L NaOH溶液、2mL 1.0×10^-3mol/L CTAC和一定浓度的某种干扰物质，稀释至刻度；

振荡摇匀，静置20min后测定其相对荧光强度。与不加干扰物质相比，以体系荧光强度变化不超过±5％为界确定干扰物质是否有干扰。按照上述实验方法，对测定肾上腺素时常见金属离子和药物赋形剂的干扰情况进行实验分析，测定结果见表1。

表1干扰物质对测定肾上腺素的影响(C_E＝5.0×10^-6mol/L)

实施例4

肾上腺素注射液的测定

取不同批号的盐酸肾上腺素注射液(标示量均为：1mL:1mg)各1支，分别移至25mL棕色容量瓶中定容，然后再分别用二次水稀释至浓度分别为2.0×10^-5和5.0×10^-5mol/L(见表2)，这些溶液作为样品溶液。另取四支10mL的比色管，分别按如下步骤加入溶液：1号和3号比色管中依次分别加入1mL 2.0×10^-5mol/L两种批号的肾上腺素样品溶液、1mL 1.0×10^-2mol/L Tb(III)―EDTA溶液、1mL 0.1mol/L NaOH溶液和2mL 1.0×10^-3mol/L CTAC，稀释到刻度；2号和4号比色管中依次分别加入1mL5.0×10^-5mol/L两种批号的肾上腺素样品溶液、1mL1.0×10^-2mol/L Tb(III)―EDTA溶液、1mL0.1mol/L NaOH溶液和2mL1.0×10^-3mol/L CTAC，稀释到刻度；以上各溶液摇匀，静置20min后测定其相对荧光强度(同时做试剂空白)。根据线性回归方程计算样品溶液中肾上腺素的浓度；相同样品溶液按照药典方法(中国药典委员会2010)用高效液相色谱法测定其浓度进行对照实验。两种不同方法得到的样品分析结果见表2。

表2肾上腺素注射液测定结果(n＝5)

实施例5

样品加标回收率实验

取不同批号的盐酸肾上腺素注射液(标示量均为：1mL:1mg)各1支，分别移至250mL棕色容量瓶中定容，这些溶液作为样品溶液。另取四支10mL的比色管，分别按如下步骤加入溶液：1号和3号比色管中依次分别加入1mL不同批号稀释后的样品溶液、1mL1.0×10^-5mol/L肾上腺素标准溶液、1mL 1.0×10^-2mol/L Tb(III)―EDTA溶液、1mL 0.1mol/L NaOH溶液和2mL 1.0×10^-3mol/L CTAC，稀释至刻度；2号和4号比色管中所加溶液和方法同上，区别之处是肾上腺素标准溶液的加入量是1mL 3.0×10^-5mol/L。以上各溶液摇匀，静置20min后测定其荧光强度(同时做试剂空白)，根据线性回归方程计算样品溶液中肾上腺素的加标回收率，所得分析结果见表3，回收率在97–101％之间。

表3肾上腺素注射液加标回收率(mean±SD，n＝5)

尽管已经详细描述了本发明的实施方式，但是应该理解的是，在不偏离本发明的方法和范围的情况下，可以对本发明的实施方式做出各种改变、替换和变更。