一种测量双光子吸收截面的方法与流程

本发明属于光学检测领域，是一种新的测量双光子吸收截面的方法。这种测量方法可基于任何一台双光子荧光显微镜，通过双光子荧光法获取荧光材料的光强信息来测量材料的双光子吸收截面。

背景技术：

双光子荧光(Two-Photon Fluorescence,2PF)是指荧光材料在高峰值功率脉冲激光激励下同时吸收光源的两个光子跃迁到激发态，再驰豫回到基态而发射出光子的一个过程。通常使用双光子作用截面(Two-PhotonActionCross-Section,ηδ)来表征材料的双光子荧光发射效率，它表示材料吸收入射光子并发射出双光子荧光的能力，等于材料的双光子吸收截面(2PA,Two-PhotonAbsorption Cross-Section,δ)与荧光量子产率(Fluorescence Quantum Yield,η)的乘积。其中，2PA截面表征材料分子发生双光子吸收的概率，反映了材料进行双光子吸收的能力。测量2PA截面的方法大致可以分为两大类，一类是从吸收截面的定义出发，进行直接测量，如非线性透过率法。用这种方法测2PA截面时，入射光功率需要很大，且所需材料的浓度比较高。此外，用此方法测量2PA截面缺乏一个参照来确定测量所用入射光功率与材料浓度是否处在一个合理的范围内。因此透过率法测得的结果容易产生比较大的误差。另外，透过率法测量对光源的功率要求比较高，普通的飞秒OPO功率往往不够，需要采用峰值功率比较高的飞秒OPA作为光源。

另一种测量2PA截面的方法是从2PA截面的效果出发，进行间接测量。如双光子荧光法测2PA截面，其大致思路：

材料产生的双光子荧光强度F与2PA截面δ的关系可表示为：

F＝δN_AcηLnI²K (1)

其中，N_A是阿伏加德罗常数，c是材料的摩尔浓度，η是材料的荧光量子产率，L表示材料的通光长度，I是入射光的强度，K是一个与光学系统的收集效率有关的一个常数。这种方法可以通过测量材料的双光子荧光强度从而反推出它的2PA截面。由于很难直接求得光学系统的收集效率，故通常采用比较法来测量，即寻找一个与待测样品双光子荧光光谱接近、且2PA截面已知的参照材料，在相同的光学环境下分别测量它们的双光子荧光，再通过参照材料的2PA截面推算出样品的2PA截面。其计算公式：

其中下标1与0分别代表样品与参照材料。由于K是一个与光学系统的通光长度与收集效率有关的常数，因此在相同的光学测量环境下，K值是相同的，即K₁＝K₂。所以，只要在相同的光学环境下，分别测得两者的双光子荧光强度F₁、F₀，并且知道它们的摩尔浓度c₁、c₀，荧光量子产率η₁、η₀，溶液的折射率n₁、n₀，以及参照材料的2PA截面δ₀，就可以得到样品的2PA截面δ₁。相较于非线性透过率法，双光子荧光法的优势主要有两点。一、双光子荧光强度与入射光强度成平方关系，可以在实验过程中减少其他非线性吸收及线性吸收带来的影响。二、荧光法测量中所用的入射光功率与材料浓度分别比透过率法低很多，这也大大减少了其他非线性吸收与线性吸收的贡献。通过减少这些干扰，双光子荧光法通常可以比非线性透过率法测得更为准确的2PA截面。

2PA截面没有成熟的商业化仪器可以使用，一般都需要自己搭建光路来测量材料的荧光光谱，进而对光谱强度进行波长积分，并用公式(2)进行计算的。然而，通过光谱仪测量的是荧光材料发射的荧光信号被散射的部分，而这部分荧光是很弱的，且容易受到环境中其他杂散光的影响，因此所测得的信号有比较大的误差。为了解决这个问题，进一步提高检测的精度，本发明设计了一种新的测量双光子吸收截面的方法，即直接用双光子荧光显微镜来获得待测样品的双光子荧光光强信号，进而用公式(2)计算得到其2PA截面。

技术实现要素：

本发明基于双光子荧光显微镜，提出了一种全新的双光子吸收截面测量方法。本发明将飞秒激光引入扫描显微系统作为光源，飞秒激光经过物镜聚焦后激发待测材料的双光子荧光信号，荧光信号进而被响应灵敏的光电倍增管(Photonmultiplier Tube，简称PMT)接收，经过光电转换、数据采样、处理后在计算机上成像。再减去材料双光子荧光成像的背景，而后可读取材料双光子荧光成像图中荧光强度的值作为双光子荧光强度信号，代入公式(2)计算即可得到待测材料的2PA截面。

本发明采用的技术方案是：

2PA截面测量系统基于双光子荧光显微成像系统，主要包括飞秒激光光源、二向色镜、PMT、信号放大器、计算机等。

双光子荧光显微成像系统可以针对所激发的荧光材料的特性，选择合适波长的飞秒激光光源以及合适的PMT接收荧光信号，通过程序读取光强信息，代入计算公式(2)就可以算出材料的2PA截面。

本发明的效益：本发明提出的2PA截面测量方法基于稳定的双光子荧光显微成像系统，较传统的2PA截面测试方法，大大减小了测量结果的误差，且测量方法更为简便、可靠，适合非光学专业(如材料、化学、生物等)的人员进行操作。

附图说明

图1为用于测量荧光材料2PA截面的双光子显微成像系统示意图；

图2为用双光子显微成像系统测得的毛细管内荧光材料的双光子荧光成像图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明作进一步说明。

如图1所示，本发明中的测量系统基于双光子荧光显微成像系统，主要包括飞秒激光光源、振镜扫描单元、二色镜、PMT、信号放大器、数据采集卡、计算机等。振镜扫描单元、二色镜、PMT等构成扫描显微系统[这里以奥林巴斯正置扫描显微成像系统(Olympus,BX61+FV1200)为例]

首先，外置的飞秒激光引入奥林巴斯正置扫描显微成像系统(Olympus,BX61+FV1200)，进入振镜扫描单元后经扫描透镜(scan lens)与镜筒透镜(tube lens)形成扩束光束再经一块长反短通(截止波长：980nm)二向色镜反射，由物镜会聚激发荧光材料，产生双光子荧光信号，材料激发出的荧光沿原光路返回，通过980nm长反短通二向色镜，以及相应的滤光片(进一步滤除飞秒激发光)后被响应灵敏的PMT接收；PMT将模拟信号转换为数字信号，经过信号放大器放大后被计算机采集，系统内的振镜扫描单元也与计算机连接以实现信号扫描的同步。通过这样一套系统，可以得到材料的双光子荧光显微成像图(如图2)。图2中的荧光强度F₁可先用程序1减去背景光，再用MATLAB程序2计算得到。用同样的方法得到参照荧光染料罗丹明Rh6G的双光子荧光强度F₀。之后将待测材料与参照材料的光强信息F₁和F₀代入公式(2)可以算出材料的2PA截面。

本实例中采用了大模场面积(large-mode-area)掺Yb(ytterbium-doped)的光子晶体光纤(Photonic Crystal Fiber,PCF)激光器(脉宽:140fs，重复频率:50MHz，波长:1040nm)作为飞秒光源。二色镜是截止波长为980nm的长反短通二向色镜，二色镜之后的滤光片是590nm的长通滤光片；物镜是奥林巴斯的25倍水镜，工作距离为2mm，且在400nm～1600nm光波段具有良好的透过率；PMT可以响应185-800nm波段的光信号。所选用的双光子荧光材料选用半导体聚合物纳米颗粒(Semiconducting Polymer Dots,P-dots)，其吸收光谱位于350-450nm，荧光峰在650nm左右。罗丹明Rh6G为参照荧光材料。

1.减去背景的程序

clear；

const＝1；

I₀＝imread(背景成像.bmp')；

I₁＝imread('图2.bmp')；

J₁＝rgb2gray(I₁)；

K＝(J₁-J₀)*const；

imwrite(K,'图2实际强度.bmp')；

2.读取图2荧光强度信息的程序

clear；

I＝imread('图2.bmp')；

J＝rgb2gray(I)；

K＝J(find(J>＝0))；

s₀＝sum(sum(K))

综上，本发明陈述了一种新颖的测量2PA截面的方法。本发明选择奥林巴斯正置扫描显微镜(Olympus,BX61+FV1200)，引入外置1040nm飞秒激光作为激发光源，激发P-dots发射出双光子荧光信号(用罗丹明Rh6G作为参照)，得到了双光子荧光成像图。再通过MATLAB读取成像图的荧光强度后代入计算2PA截面的公式(2)，即可算出待测材料的2PA截面。这一套用双光子荧光显微成像系统测量荧光材料2PA截面的方法，相较于传统的测量方法，收集效率更高，操作更方便，误差更少，稳定性更高，性能更可靠。