一种利用表面增强拉曼光谱检测百草枯的方法与流程

本发明涉及一种百草枯的检测方法，尤其涉及一种利用表面增强拉曼光谱检测百草枯的方法。

背景技术：

随着科技的进步，农药在农业中的使用日益变得广泛。但农药在农产品中的残留给人身安全带来危害。农产品中残留的农药被食用后，在人体内部逐步积累，引起慢性中毒危害人身安全。

百草枯作为速效触杀型灭生性季胺盐类除草剂，具有高效除草效果，广泛应用于果蔬庄稼作物种植过程中。目前全世界超过130个国家和地区在大量使用含百草枯成份的农药。由于百草枯的化学分子结构稳定，不易降解，在农药施用后很长时间存留在植物组织中。并且由于百草枯具有强水溶性，使得百草枯施用后能够长时间残留在土壤水体中，随植物的蒸腾作用被运输到植物各个组织中，造成农产品的污染。由于百草枯对人和牲畜有较强的生理毒性且无特效解药，世界范围内每年均有百草枯急性或慢性致死案例。由于百草枯相比于同类农药具有更高的效果，因而终止百草枯在世界范围内的使用是不现实的，因而加强对农产品中百草枯的检测，对世界卫生安全具有重要的现实意义。

现有技术中百草枯的检测方法主要包括酶联免疫法(ELISA)、高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱联用法(LC-MS/MS)、紫外分光光度法和生物传感器法等。主流的检测手段主要采用色谱-质谱手段对百草枯分子进行分离和识别，由于百草枯是一种强极性离子型化合物，能够对色谱柱和质谱离子源造成损害，缩短仪器寿命，提高检测成本。美国分析化学家协会(AOAC)现行推荐的百草枯检测方法需要对百草枯阳离子进行还原反应，衍生化后进行检测，提取步骤十分复杂，需要在硫酸中回流5h以上，操作复杂。由于色谱-质谱法检测前处理程序复杂、操作繁琐、耗时长、检测成本高，而而酶联免疫法容易产生假阳性和假阴性结果，生物传感器法检测结果的准确性和稳定性还有待提高。所以现有技术所提供的检测百草枯的方法并不能实现对百草枯快速、廉价、准确和灵敏的检测。

拉曼光谱分析技术是基于印度科学家C.V.拉曼所发现的拉曼散射效应，对与入射光频率不同的散射光谱进行分析以得到分子振动、转动方面信息，并应用于分子结构研究的一种分析方法。表面增强拉曼光谱(Surface enhanced Raman spectroscopy，SERS)技术采用经特殊处理表面粗糙化的金属，通过把被分析有机物吸附在粗糙金属表面，使得被分析物的拉曼散射信号增强10⁵～10¹⁴，从而克服常规激光拉曼光谱技术灵敏度低的缺点。SERS技术为食品及复杂生物体系中痕量物质的快速、灵敏检测提供一种新的途径，被广泛应用于痕量有机分子的分析。现有技术中采用银纳米粒子溶胶利用SERS检测技术对百草枯分子进行检测，检测限可达到0.1mg/mL，但低于0.1mg/mL浓度的百草枯含量依然能通过积累效应对人体产生毒害。

果汁、蔬菜汁等饮料成分复杂，会对检测基底产生干扰，影响检测结果灵敏度。因此需要对现有技术加以改进，能够快速、高效、准确的测定出果汁等样品中痕量的百草枯。

技术实现要素：

本发明提供一种利用表面增强拉曼光谱检测百草枯的方法，该方法能够简便快捷的实现样品尤其是饮料中百草枯含量的准确检测，并且灵敏度好，选择性高。

本发明技术方案为：一种利用表面增强拉曼光谱检测百草枯的方法，步骤包括：

(1)待测样品用弱阳离子交换树脂预处理，收集洗脱液；

(2)用金纳米颗粒溶胶做基底，通过表面增强拉曼光谱检测洗脱液。

待测样品为果汁、蔬菜汁或者其混合物，尤其是苹果汁。且待测样品中不含固体悬浮物。

待测样品中糖含量为8wt％～20wt％，糖酸比为10～15：1。优选的，样品中糖含量为10wt％～13wt％，糖酸比为11～14：1。

进一步，步骤(1)所述预处理的步骤包括：

a.用体积比为0.5～1.5：1的甲醇与超纯水的混合液作为活化液，对弱阳离子交换树脂柱进行活化；

b.将待检测样品上样；

c.用淋洗液进行淋洗；所述的淋洗液为体积比0.5～1.5：1的甲醇与水的混合液；

d.用洗脱剂进行洗脱，并收集洗脱液；所述的洗脱剂为体积比1.5～2.5：70～100：9～16的甲酸、甲醇和水的混合液。

所述活化液、待测样品、淋洗液、洗脱剂的体积比为4～8：5：2～4：1～3；所述活化液中甲醇与水的体积比为0.5～1.5：1；所述淋洗液中甲醇与水的体积比为0.5～1.5：1；所述洗脱剂中甲酸、甲醇与水的体积比为1.5～2.5：70～100：9～16。

优选的，所述活化液、待测样品、淋洗液、洗脱剂的体积比为5～7：5：2.5～3.5：1.5～2.5；所述活化液中甲醇与水的体积比为0.9～1.1：1；优选的，所述淋洗液中甲醇与水的体积比为0.9～1.1：1；优选的，所述洗脱剂中甲酸、甲醇与水的体积比为1.8～2.2：80～90：11～15。

更为优选的，所述活化液、待测样品、淋洗液、洗脱剂的体积比为6：5：3：2；所述活化液中甲醇与水的体积比为1：1；更为优选的，所述淋洗液中甲醇与水的体积比为1：1；更为优选的，所述洗脱剂中甲酸、甲醇与水的体积比为2：85：13。

进一步，步骤(1)所述的预处理步骤还包括：弱阳离子交换树脂柱洗脱得到的洗脱液用孔径为0.2～0.3μm滤膜过滤。

优选的，所述金纳米颗粒溶胶粒径为64±6nm。

进一步，所述金纳米颗粒溶胶的制备方法包括以下步骤：将氯金酸溶液加热至沸腾，加入柠檬酸三钠溶液后搅拌并保持沸腾10～25min。更优选的，可将产物冷却离心，弃去上清液，得到金纳米颗粒溶胶(离心浓缩倍数约5～20倍)。

所述氯金酸、柠檬酸三钠的质量比为1：0.5～1.5，优选为1：0.6～1；所述柠檬酸三钠溶液的浓度为0.5wt％～1.5wt％，优选为0.8wt％～1.2wt％；所述氯金酸溶液的浓度为0.005wt％～0.015wt％，优选为0.009wt％～0.011wt％。

进一步，所述金纳米颗粒溶胶的制备方法包括以下步骤：将浓度为0.01wt％的氯金酸溶液加热至沸腾，加入浓度为1wt％柠檬酸三钠溶液后搅拌并保持沸腾12～15min；氯金酸溶液与柠檬酸三钠溶液的体积比为100：0.7；产物冷却离心，弃去上清液，得到金纳米颗粒溶胶(离心浓缩倍数约5～20倍)。

进一步，所述表面增强拉曼光谱检测中采用的激光波长优选为780nm，扫描范围优选为550～2000cm^-1。

在1645±5cm^-1特征峰下，峰强度与百草枯浓度线性相关。测定不同百草枯浓度的标准样品表面增强拉曼光谱强度，绘制标准曲线，采用标准曲线法定量检测待测样品中百草枯的浓度。

本发明的有益效果在于，提供了一种利用表面增强拉曼光谱检测百草枯的方法，果汁、蔬菜汁等样品经过弱阳离子交换树脂预处理，然后采用金纳米颗粒溶胶做基底，通过表面增强拉曼光谱检测样品中百草枯。在1645±5cm^-1下，峰强度与百草枯浓度线性相关，从而可以对百草枯进行定量检测。该方法能够快速、有效地定性或定量检测样品中百草枯。

本发明的方法灵敏度高，检测限低，能够有效定性或定量检测出果汁等样品中残留的百草枯，检测限0.02μg/mL，优于欧盟的最低检测限标准(0.05μg/mL)，而未经过弱阳离子交换树脂预处理的样品，百草枯含量的检测限为5μg/mL。因此本技术方案实现了百草枯农药的实用、快速、高效、低成本检测。

附图说明

图1为百草枯标准品的拉曼光谱；

图2为实施例1金纳米颗粒TEM图；

图3为百草枯标准溶液SERS谱图；

图4为经过WCX柱预处理的含百草枯苹果汁SERS谱图；

图5为苹果汁中百草枯含量的定量分析模型；

图6为直接混合法测定苹果汁中百草枯SERS谱图；

图7为采用不同尺寸金纳米颗粒为基底的百草枯标准溶液SERS谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。实施例中所采用的苹果汁含糖量在12～13g/100mL之间，糖酸比在13～15：1范围内。

实施例1 金纳米颗粒溶胶的制备

将100mL浓度为0.01wt％的氯金酸溶液倒入烧瓶中，放在恒温磁力搅拌器上，1100rpm剧烈搅拌并加热至溶液沸腾，然后加入0.7mL浓度为1wt％的柠檬酸三钠溶液，同时以1100rpm剧烈搅拌并保持沸腾15min，冰浴迅速结束反应，待反应液冷却后，取15mL离心后弃除上层清液(约14mL)，取下层的金纳米颗粒水溶胶，用于后续的检测。

对所制备的金纳米颗粒进行检测，结果如图2，所制备的金纳米颗粒平均粒径为64±6nm，尺寸均匀，分散度好。

实施例2 百草枯标准溶液的检测

首先配制梯度浓度的百草枯标准水溶液(10μg/L、5μg/L、2μg/L、1μg/L、0.5μg/L、0.2μg/L、0μg/L)，将标准水溶液用0.22μm滤膜过滤后，取50μL置于1.5mL离心管中，加入等体积的金纳米颗粒溶胶(实施例1制备)混合，涡旋振荡10s后，取5μL混合液滴加至干净的硅片上，烘干后采用显微拉曼光谱仪进行表面增强拉曼光谱测定。显微拉曼光谱仪功率为80mW，激光波长为780nm，采集的波谱范围为550～2000cm^-1。

梯度浓度的百草枯标准溶液测试结果如图3所示，百草枯标准品的拉曼谱图如图1所示。根据图3分析可知，本技术方案所提供的SERS技术对百草枯标准溶液的最低检出浓度为0.2μg/L，说明以金纳米颗粒溶胶作为基底的SERS检测百草枯的方法具有高灵敏性。

实施例3 苹果汁中百草枯的直接测定

苹果汁中加入百草枯母液，配制0～20μg/mL梯度浓度的百草枯的苹果汁样品并经过0.22μm滤膜过滤，取50μL置于1.5mL离心管中，加入等体积金纳米颗粒溶胶(实施例1制备混合)，振荡10s后，取5μL滴在干净硅片上，烘干，采用显微拉曼光谱仪进行测定。显微拉曼光谱仪功率80mW，激光波长780nm，扫描范围550～2000cm^-1。

所获得的SERS谱图如图6所示，可以看出采用直接混合法测定苹果汁中百草枯含量，最低检测浓度为5μg/mL。

实施例4 用弱阳离子交换树脂预处理苹果汁样品并检测百草枯

(一)用弱阳离子交换树脂预处理苹果汁样品

苹果汁中加入百草枯母液，配制梯度浓度的含百草枯的苹果汁(百草枯浓度分别为0.02μg/mL、0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL)，然后将含有百草枯的苹果汁用CNWBOND WCX弱阳离子交换SPE小柱(60mg，3mL；上海安谱实验科技股份)预处理。

具体操作为：①取6mL等体积比的甲醇-超纯水混合液对WCX小柱进行活化；

②取5ml待测的苹果汁上样；

③取3ml等体积比的甲醇-水溶液进行淋洗；

④取2ml甲酸-甲醇-水进行洗脱，其中甲酸、甲醇和水的体积比为2：85：13；并且采用孔径为0.22μm的PVDF针式滤膜过滤洗脱液。

(二)苹果汁中百草枯含量的测定

将所得洗脱液与等体积的金纳米颗粒溶胶(实施例1制备)混合，然后涡旋振荡10秒钟，得到检测溶液。

取5μL检测溶液滴加到干净的硅片上，并烘干，然后通过显微拉曼光谱仪进行测定。显微拉曼光谱仪功率为80mW，激光波长为780nm，采集的波谱范围为550～2000cm^-1，SERS谱图如图4所示。

结合图4的SERS谱图可知，百草枯的最强特征峰为1646cm^-1，在该特征峰下绘制的工作曲线如图5所示，并可得出1646cm^-1下峰强度与百草枯浓度线性相关，R²为0.982，均方根误差为0.04，相对分析误差为7.50。根据图4可知，采用金纳米颗粒溶胶做SERS检测的基底检测苹果汁中的百草枯，检测限可以达到0.02μg/mL，优于欧盟设定的苹果汁中百草枯最低检出浓度(0.05μg/mL)。

与百草枯标准水溶液的检测限(0.2μg/L)相比，经过弱阳离子交换树脂小柱(WCX)处理后，苹果汁中百草枯的含量检测限为0.02μg/mL，而未经预处理的苹果汁，直接进行表面增强拉曼光谱检测的检测限为5μg/mL(如图6)。这是由于苹果汁中的除了水之外的主要成分诸如糖、氨基酸、有机酸、色素等有机分子会对表面增强拉曼光谱检测方法造成干扰。将苹果汁经过弱阳离子交换树脂小柱(WCX)处理后，所得到的洗脱液中糖、氨基酸、有机酸、色素分子含量降低，减少了对百草枯分子的拉曼光谱干扰。将图4与图6相比，可以看出未经过弱阳离子交换树脂小柱处理的苹果汁做得到的测试谱图基线波动很大，杂峰较多；而经过弱阳离子交换树脂小柱处理后，如图4所示，极限很平整，并且杂峰数量减少，有效提高了检测灵敏度。

由于果汁成分来自于植物果皮细胞中液泡内部的细胞液，无论何种水果，其果汁主要成分均为糖、氨基酸、有机酸、色素和水。因此本领域的普通技术人员有理由相信本具体实施方式用于苹果汁的检测方法对多种果汁、蔬菜汁均具有普适性。

实施例5 金纳米颗粒尺寸对百草枯检测灵敏度的影响

按实施例1的方法，通过改变柠檬酸三钠的用量，得到粒径大小不同的金纳米颗粒溶胶。分别取粒径23nm、49nm和102nm的金纳米颗粒溶胶，以及实施例1所制备的64±6nm金纳米颗粒溶胶，然后与等体积0.05μg/mL的百草枯标准水溶液混合，涡旋10s。取5μL混合液滴加至干净的硅片上，烘干后进行表面增强拉曼光谱测定。显微拉曼光谱仪功率为80mW，激光波长为780nm，采集的波谱范围为550～2000cm^-1。

测试结果如图7所示，根据图7分析可知，当金纳米颗粒尺寸处于64±6nm时，所测得的表面增强拉曼光谱的特征峰强度最大，因此采用粒径64±6nm的金纳米颗粒溶胶进行百草枯的检测最为灵敏。

需要指出的是，上述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项目技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。