利用UFLC法同时检测山茱萸中5种三萜酸成分的方法与流程

本发明涉及成分检测领域，具体涉及利用UFLC法同时检测山茱萸中5种三萜酸成分的方法。

背景技术：

山茱萸为山茱萸科植物山茱萸(Cornus offcinalis Sieb.et Zucc)的干燥成熟果肉，味酸、涩，性微温，归肝、肾经，具有补益肝肾、涩精固脱的功效。近年来山茱萸及其提取物已被证明有多种药理活性，如抗炎、抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂、保肝以及神经保护等作用。山茱萸中主要化学成分有环烯醚萜苷类、鞣质、黄酮、有机酸、多糖、三萜类、挥发性成分等。山茱萸中的三萜酸大部分属于三萜类中的五环三萜酸，目前检测到山茱萸三萜酸成分主要包括熊果酸、齐墩果酸、山楂酸、科罗索酸、白桦脂酸，参见袁菊丽等.山茱萸的主要化学成分及药理作用[J].化学与生物工程,2011,05:7-9；刘博等.HPLC法测定山茱萸中科罗索酸的含量[J].药物分析杂志,2011,12:2217-2219；刘博,吴和珍.山茱萸药材中三萜类成分的研究[J].湖北中医杂志,2010,12:75-76。已有研究表明山茱萸中的三萜酸可以降低血糖、改善糖尿病并发症如心肌病变、视网膜病变、糖尿病肾病等，因此检测山茱萸中三萜酸成分及其含量对于预防和治疗糖尿病及其并发症具有指导意义。

目前关于山茱萸中三萜酸成分都是独立检测，金德庄等运用HPLC的方法分析山茱萸中熊果酸、齐墩果酸含量，刘博等运用HPLC法检测山茱萸中科罗索酸含量，山楂酸和科罗索酸、齐墩果酸和熊果酸为同分异构体，这5种酸同为山茱萸中三萜酸其结构和性质相似，用高效液相色谱法测定分析时间较长且不易分离，如何快速、准确地同时测定山茱萸中山楂酸、科罗索酸、白桦脂酸、齐墩果酸和熊果酸含量具有重要意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术中存在的问题，提供一种利用UFLC法同时检测山茱萸中5种三萜酸成分的方法，能够快速检测出山茱萸中5种三萜酸成分含量，且精确度高。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

包括以下步骤：

(1)分别配置熊果酸、齐墩果酸、山楂酸、科罗索酸和白桦脂酸的对照品溶液，对对照品溶液进行色谱分析，获得熊果酸、齐墩果酸、山楂酸、科罗索酸和白桦脂酸的峰面积，以对照品溶液的进样量为横坐标，对照品溶液中各组分的峰面积为纵坐标分别绘制标准曲线；

(2)向山茱萸粉末中加入提取剂，提取得到样品溶液，将样品溶液抽滤，所得滤液为供试液；

(3)对供试液进行色谱分析，获得供试液中各被测组分的峰面积，以供试液中各被测组分的峰面积为纵坐标代入标准曲线中，得出供试液中各被测组分的进样量，再计算得到供试液中熊果酸、齐墩果酸、山楂酸、科罗索酸和白桦脂酸的含量，完成利用UFLC法同时对山茱萸中5种三萜酸成分的检测。

进一步地，步骤(1)中采用甲醇分别配置熊果酸、齐墩果酸、山楂酸、科罗索酸和白桦脂酸的对照品溶液。

进一步地，步骤(1)中熊果酸、齐墩果酸、山楂酸、科罗索酸和白桦脂酸的对照品溶液的浓度分别为0.8mg/mL、0.1mg/mL、0.005mg/mL、0.005mg/mL和0.001mg/mL。

进一步地，步骤(2)中提取剂为体积分数40～80％乙醇溶液。

进一步地，步骤(2)中山茱萸粉末和提取剂之比为1g：(5～25)mL。

进一步地，步骤(2)中提取6～15min。

进一步地，步骤(2)中在超声微波组合反应系统中提取，其中，微波功率为100～500W，超声功率为120～600W。

进一步地，步骤(2)中提取的温度为40～80℃。

进一步地，步骤(2)中向所得滤液中加入提取剂，直至所得溶液重量与样品溶液重量相同，得到供试液。

进一步地，步骤(1)和步骤(3)的色谱分析条件为：Shim-pack XR-ODS III色谱柱，规格2.0mm×75mm×1.6μm；流动相：体积比为84:16的甲醇-40mmol/L磷酸二氢钾缓冲液；流速0.2mL/min；检测波长：210nm；柱温：35℃；进样体积：1μL。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明应用超高效液相色谱(UFLC)法，对山茱萸成分进行分析研究，具有超强的分离能力及超高灵敏度，其在峰容量、分析效率、灵敏度和分辨率方面均优于常规HPLC，可在极短的时间内达到柱平衡或重新平衡，显著减少分析时间，在9.0min内即可获得很好的分离效果；同时会减少溶剂、样品消耗，该方法精密度高、重现性好、操作简便，测定结果准确可靠，是一种高效、环保、可行的质量评价技术。该法快速、简便、分离效果好，准确度好，可用于山茱萸药材有效成分分析及质量控制。

进一步地，本发明通过调节料液比、提取时间、微波功率和超声功率等条件，提高提取率。

【附图说明】

图1是对照品的色谱图。

图2是山茱萸样品的色谱图。

图3是不同料液比对总三萜酸提取率结果比较曲线图。

图4是不同提取时间对总三萜酸提取率结果比较曲线图。

图5是不同提取温度对总三萜酸提取率结果比较曲线图。

图6是不同乙醇浓度对总三萜酸提取率结果曲线比较图。

图7是不同微波功率对总三萜酸提取率结果比较曲线图。

图8是不同超声功率对总三萜酸提取率结果比较曲线图。

其中：1.山楂酸2.科罗索酸3.白桦脂酸4.齐墩果酸5.熊果酸。

【具体实施方式】

下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步详细说明。

1.仪器与材料

Nexera UHPLC LC-30A(日本SHIMADZU)：LC-30AD二元泵系统，SIL-30AC自动进样器，SPD-20A UFLC紫外可见检测器，CTO-30A柱温箱；超纯水仪(美国Milipore公司)；精密微量移液器(德国Eppendorf公司)；AL204电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；超声波微波组合反应系统(南京先欧仪器制造有限公司)；SYFM-8Ⅱ型微粉机(济南松岳机器)。

熊果酸对照品(成都曼斯特生物科技有限公司，批号：MUST-15082905)，齐墩果酸对照品(成都曼斯特生物科技有限公司，批号：MUST-15030105)，山楂酸对照品(成都曼斯特生物科技有限公司，批号：MUST-16072803)，科罗索酸对照品(成都曼斯特生物科技有限公司，批号：MUST-16052204)，白桦脂酸对照品(成都曼斯特生物科技有限公司，批号：MUST-16032403)。甲醇、磷酸二氢钾为色谱纯，水为超纯水。山茱萸采自陕西省丹凤县，经陕西师范大学生命科学学院肖娅萍教授鉴定为山茱萸(Cornus offcinalis Sieb.et Zucc.)的干燥成熟果肉。将以上药材干燥，粉碎，干燥保存，备用。

2.方法与结果

2.1混合对照品溶液的制备

分别精密称取熊果酸、齐墩果酸、山楂酸、科罗索酸对照品各0.7mg，白桦脂酸对照品1.4mg，甲醇溶解，1mL容量瓶定容。分别精密量取上述5种对照品溶液各200μL置于1mL容量瓶中，0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，将续滤液混合即得混合对照品溶液。

2.2供试品溶液的制备

精密称取山茱萸粉末1.00g，置于XO-200型专用玻璃反应瓶中，加体积分数为60～90％的乙醇溶液5～25mL密封，称重质量为A，连接好回流装置，于XO-200超声微波组合反应系统中提取6～15min，其中，微波功率100～500W，超声功率120～600W，温度40～80℃，取出，抽滤，所得滤液再用体积分数为60～90％乙醇溶液补至原重量A，摇匀，0.22μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试液。

2.3色谱条件

色谱柱为Shim-pack XR-ODS III(2.0mm×75mm，1.6μm)；流动相：甲醇-40mmol/L磷酸二氢钾缓冲液(84:16，v/v)；流速0.2mL/min；检测波长：210nm；柱温：35℃；进样体积：1μL。在上述色谱条件下，各被测组分理论塔板数均不低于8000，样品中各被测组分与相邻峰分离度均大于1.5，混合对照品色谱图见图1。

2.4方法学考察

本发明包括以下步骤：

(1)分别配置熊果酸、齐墩果酸、山楂酸、科罗索酸和白桦脂酸的对照品溶液，对对照品溶液分别进行色谱分析，分别获得熊果酸、齐墩果酸、山楂酸、科罗索酸和白桦脂酸的峰面积，以对照品溶液的进样量为横坐标，对照品溶液中各组分的峰面积为纵坐标分别绘制标准曲线；

M＝V_标×C_标，其中M为对照品溶液的进样量，μg；V_标是对照品溶液的进样体积，μL；C_标是对照品溶液的浓度，mg/mL。

(2)按以上2.2获取供试液；

(3)按以上2.3的色谱条件，对供试液进行色谱分析，获得供试液中各被测组分的峰面积，将供试液中各被测组分的峰面积为纵坐标代入标准曲线中，得出供试液中各被测组分的进样量，再计算得到供试液中熊果酸、齐墩果酸、山楂酸、科罗索酸和白桦脂酸的含量，完成利用UFLC法同时对山茱萸中5种三萜酸成分的检测。

X＝(m×V_供)/V_样。X是供试液中各被测组分的含量；m为供试液中各被测组分的进样量；V_供为供试液体积，V_样为供试液的进样体积。

2.4.1线性关系的考察

精密称取熊果酸对照品0.8mg，齐墩果酸对照品0.8mg，山楂酸、科罗索酸、白桦脂酸对照品各1.3mg，甲醇溶解，1mL容量瓶定容。将上述溶液分别稀释成0.8mg/mL熊果酸、0.1mg/mL齐墩果酸，0.005mg/mL山楂酸，0.005mg/mL科罗索酸，0.001mg/mL白桦脂酸。分别进熊果酸和齐墩果酸对照品溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.8、1.0μL，山楂酸和科罗索酸1、2、3、4、5、6μL，白桦脂酸2、3、4、6、8、10μL。在上述色谱条件下分析，以进样量为横坐标，各组分在色谱图中的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。各对照品只有在上述浓度下表现出良好的线性关系。各组分的线性关系见表1，各组分线性关系良好。

表1山茱萸5中成分回归方程

2.4.2精密度试验

取2.1的混合对照品溶液，按上述色谱条件连续进样5次，测定山楂酸、科罗索酸、白桦脂酸、齐墩果酸、熊果酸各组分峰面积，计算RSD分别为1.01％，1.27％，1.76％，1.98％，2.13％，说明仪器精密度良好。

2.4.3重复性试验

称取1.00g山茱萸样品5份，按上述制备供试品溶液方法制备，按上述色谱条件进样分析，计算山楂酸、科罗索酸、白桦脂酸、齐墩果酸、熊果酸各组分含量RSD分别为2.08％，1.16％，2.08％，1.38％，0.56％，说明仪器重现性良好。

2.4.4稳定性试验

取山茱萸供试品溶液，按上述色谱条件下分别于0、2、4、8、12h进样分析，测得山楂酸、科罗索酸、白桦脂酸、熊果酸、齐墩果酸峰面积的RSD分别为1.86％，1.20％，2.19％，1.34％，0.55％，说明样品在12h内稳定性良好。

2.4.5加样回收试验

称取已知含量的山茱萸样品3份，分别加入一定量山楂酸、科罗索酸、白桦脂酸、齐墩果酸、熊果酸对照品溶液，制备供试品溶液，进样测定，计算加样回收率。结果见表2。

表2 5种酸加样回收率试验结果(n＝9)

2.4.6样品含量测定

按上述供试品溶液制备方法制备样品，在上述色谱条件下分析，色谱图见图1和图2所示，测得各组分的含量分别为0.0137％，0.0169％，0.0019％，0.0528％，0.1864％。

3.实施例

本实验采用了超声-微波提取法考察了料液比、乙醇浓度、提取时间、超声功率、微波功率、提取温度对实验结果的影响。

实施例1料液比的选择

本实例实验选取料液比1:5、1:10、1:15、1:20、1:25五种料液比分别对山茱萸粉末进行提取，取山茱萸粉末1g置于XO-200型专用玻璃反应瓶中，分别加入不同体积60％乙醇，超声功率300w，温度50℃，微波功率400w，提取时间5min。分别取上清液，用香草醛-高氯酸显色法测定总三萜酸含量；如图3所示，结果表明，在1:5～1:15时随着料液比的增大，提取率升高，料液比为1:20～1:25时，提取率变化减小，故本发明中料液比确定为1:15～1:25，考虑到节省溶剂目的，故选取1:20为最佳料液比。

实施例2提取时间的选择

本实例考察了不同提取时间对总三萜酸提取率的影响，取1g山茱萸粉末置于XO-200型专用玻璃反应瓶中，加入20mL体积分数60％乙醇，超声功率300w，微波功率400w，温度50℃，提取时间分别为3、6、9、12、15min，按照不同提取时间依次进行提取。分别取上清液，用香草醛-高氯酸显色法测定总三萜酸含量；如图4所示，结果表明，在提取时间为3～9min时，提取率依次增大，在提取时间为9～15min，提取率依次减小。故本发明中提取时间确定为6～15min，考虑到提取完全，选择最优提取时间为9min。

实施例3提取温度的选择

本实例考察了不同提取温度对提取率的影响，分别选取不同提取温度40℃、50℃、60℃、70℃、80℃分别对山茱萸粉末进行提取，取山茱萸粉末1g置于XO-200型专用玻璃反应瓶中，分别加入体积分数60％乙醇20mL，超声功率300w，微波功率400w，提取时间9min。分别取上清液，用香草醛-高氯酸显色法测定总三萜酸含量；如图5所示，结果表明，在提取温度为40～50℃时，提取率逐渐增大，在提取温度为50℃～80℃时，提取率逐渐下降，考虑到提取完全，最终选择提取温度50℃为最优条件。

实施例4乙醇浓度的选择

本实例考察了不同乙醇浓度对提取率的影响，分别选取不同乙醇浓度40％、50％、60％、70％、80％分别对山茱萸粉末进行提取，取山茱萸粉末1g置于XO-200型专用玻璃反应瓶中，分别加入不同体积分数乙醇20mL，超声功率300w，微波功率400w，提取时间9min。分别取上清液，用香草醛-高氯酸显色法测定总三萜酸含量；如图6所示，结果表明，在乙醇浓度为40％～60％时，提取率逐渐增大，在提取温度为60％～80％时，提取率逐渐下降，考虑到提取完全，最终选择提取温度60％为最优条件。

实施例5微波功率的选择

本实例考察了不同微波功率对提取率的影响，分别选取不同微波功率100w、200w、300w、400w、500w分别对山茱萸粉末进行提取，取山茱萸粉末1g置于XO-200型专用玻璃反应瓶中，分别加入体积分数60％乙醇20mL，超声功率300w，温度50℃，提取时间9min。分别取上清液，用香草醛-高氯酸显色法测定总三萜酸含量；如图7所示，结果表明，在微波功率为100w～200w时，提取率逐渐增大，在微波功率为300w～500w时，提取率逐渐下降，考虑到提取完全，最终选择微波功率200w为最优条件。

实施例6超声功率的选择

本实例考察了不同超声功率对提取率的影响，分别选取不同超声功率120w、240w、360、480w、600w分别对山茱萸粉末进行提取，取山茱萸粉末1g置于XO-200型专用玻璃反应瓶中，分别加入体积分数60％乙醇20mL，微波功率200w，温度50℃，提取时间9min。分别取上清液，用香草醛-高氯酸显色法测定总三萜酸含量；如图8所示，结果表明，在超声功率120w～360w时，提取率逐渐增大，在超声功率为360w～600w时，提取率下降，考虑到提取完全，最终选择超声功率360w为最优条件。

根据响应面实验，采用如下表1所示的四因素三水平对本发明进行验证。

表1试验因素水平及编码表

利用Design-Expert.8.05b软件对表1-2实验数据进行回归拟合，得到二次多项回归方程为：

R1＝32.61+3.84A+0.22B-0.73C-0.26D+0.50AB-0.46AC-0.22AD+1.44BC-0.76BD-0.30CD-0.74A²+0.81B²+0.49C²-0.91D²。

回归方程的显著性检验结果见表1-3。由表1-3可知，该模型p<0.05，表明该模型显著，失拟项不显著(p＝0.3675>0.05)，表明该模型能较好地描述个因素与响应值间的关系。相关系数R²＝0.7570，说明响应值的变化75.7％来源于模型。各因素对响应值的影响顺序是A(料液比)>B(提取时间)>C(微波功率)>D超声功率。

表1-2中心组合试验设计及结果

表1-3回归方差分析结果

注：*表示显著(0.05<P<0.01)，**表示极显著(p<0.01)

运用Design-Expert.8.05b软件和其回归方程求出最佳提取工艺为料液比1:20，提取时间9min，微波功率200w，超声功率396.67w，在该条件下测得山茱萸总三萜酸含量为38.71mg/g。考虑到实际操作具体情况，最终确定提取工艺为：料液比1:20，提取时间9min，微波功率200w，超声功率396w。在此最佳条件下进行三次重复试验，实际测得的平均含量为35.31mg/g，与理论值相比，RSD为2.04％，标准偏差为0.79，说明本发明方法可靠，可用于山茱萸总三萜酸的提取。

结果表明：60％乙醇，50℃，超声功率396W，微波功率200W，反应时间9min为最优提取条件。

本发明应用UFLC法，在9.0min内即可同时分离山茱萸中5种三萜酸成分且分离效果良好。与HPLC法相比，UFLC法分析时间短，溶剂消耗少，具有快速、环保、高效等优点。该法快速、简便、分离效果好，准确度好，可用于山茱萸药材有效成分分析及质量控制。