一种油乳剂蛋白亚单位疫苗中蛋白含量和纯度的检测方法及其应用与流程

本发明涉及一种油乳剂蛋白亚单位疫苗中蛋白含量和纯度的检测方法和应用，属于生物技术领域。

背景技术：

疫苗是目前预防传染性疾病最有效的方法之一。除安全性外，评价一个疫苗的另一个重要指标就是其免疫原性。传统的减毒活疫苗和灭活疫苗仍然是目前最为常用的疫苗，因为两种疫苗都保持了良好的病毒颗粒性状和病毒表面蛋白，并且减毒活疫苗还能在体内复制，能够有效地诱导中和抗体产生。尽管这两类疫苗目前都得到了广泛的应用，但是其毒力返强和灭活不完全的安全性问题仍然不容忽视，尤其是对于那些生物安全级别很高的病毒；另外，这两类疫苗生产工艺都较为复杂、成本较高。因此，利用重组技术来研发亚单位疫苗是现代疫苗学的一个新的方向和趋势，这类疫苗不含病毒的基因组，是一类相对安全的疫苗。且对于那些我们目前还不能培养和有效扩增的病毒，或者是培养的生物安全级别要求很高的病毒，亚单位疫苗是首要的选择。

基因工程亚单位疫苗(subunitvaccine)又称重组亚单位疫苗(recombinantsubunitvaccines)或生物合成亚单位疫苗，是利用dna重组技术将编码病原微生物保护性抗原的基因导入受体菌(如大肠杆菌)或细胞(如293t细胞)，使其在受体中高效表达，分泌保护性抗原，分离纯化保护性抗原再加入佐剂即制成基因工程亚单位疫苗。利用基因工程的方法，不仅能够克隆得到编码病毒保护性抗原的基因，而且能够在体外对其进行改造或修饰，并重新转移到异源生物宿主体内或培养细胞中，使病毒蛋白获得大量表达。基因工程亚单位疫苗就是将保护性抗原基因在原核或真核细胞中表达，再以这种生物合成的基因产物制成的疫苗。因此，应用基因工程亚单位疫苗易于大规模生产，且成本低廉。用蛋白作为抗原建立的诊断方法，可以将免疫动物和自然感染动物鉴别开来，不干扰流行病学调查；对于发病急、病程短的疾病效果较好；因此它将成为近期投入市场品种最多的生物高技术产品。

在重组蛋白类疫苗的研发中，蛋白抗原与佐剂吸附后的稳定性也是必须的检测指标之一，这就需要准确测定疫苗成品中的抗原含量。而疫苗成品多是抗原蛋白与佐剂吸附后的胶体状复合物，如何采用适当的方法让蛋白抗原与佐剂完全解离且不破坏抗原的性质，是需要重点解决的一个难题。目前的报道中，有采用柠檬酸钠、盐酸胍等方法将蛋白与佐剂解离的方法，但普遍存在解离不完全，解离时间偏长等问题。特别是在油乳剂疫苗中，由于疫苗本身为油状，使用普通方法破乳解离抗原蛋白的得率很低，且容易导致抗原蛋白变性甚至降解。

目前在成品疫苗的质检中，特别是兽用疫苗的质检中，一般采用成品疫苗按照规定的免疫程序免疫靶动物，跟踪后续的抗体效价结果或进行免疫攻毒实验，从而验证本批次疫苗是否符合要求，能否投入市场。因此，找到一种替代方法检测成品疫苗中抗原的含量和纯度是目前兽用疫苗的一个研究重点，这不仅能够节约成本和时间，也能够避免使用动物进行实验，从而节约实验动物的使用量。

技术实现要素：

鉴于上述存在的油乳剂疫苗中抗原蛋白解离效率低且易变性降解的问题，以及在成品兽用疫苗的质检中使用靶动物进行实验从而导致成本较高、质检时间长，且需要使用很多实验动物的问题，本发明提供了一种快速检测油乳剂亚单位疫苗中抗原含量和纯度的方法。

本发明的方法包括以下步骤：(1)准备标准蛋白；(2)使用卞醇从疫苗中分离出水相；(3)使用hplc检测步骤(1)中准备的标准蛋白和步骤(2)中分离出来的水相中的抗原蛋白；(4)以标准蛋白的浓度为纵坐标，以步骤(3)中检测出来标准蛋白对应的峰面积为横坐标建立标准曲线，由此得到标准曲线的函数及r²，其中r²必须大于0.99；(5)将步骤(3)中检测出来的水相中的抗原蛋白的峰面积作为(4)中函数的x代入函数中得到y值，此y值即为水相中目的蛋白的浓度；(6)以步骤(5)中水相中目的蛋白的浓度×苄醇分离疫苗时所得水相的总体积÷所取疫苗的总体积，计算得到疫苗中抗原蛋白的浓度；(7)根据步骤(3)中检测出来的水相中的抗原蛋白的峰面积占所有峰面积的比例，确定疫苗中抗原蛋白的纯度。

本发明的技术方案中，优选地，所述抗原蛋白分子量不低于80kda。

本发明的技术方案中，优选地，所述油佐剂为水包油佐剂或水包油包水佐剂。更优选地，所述油佐剂为isa201vg或白油。

本发明的技术方案中，优选地，所述标准蛋白为标定好浓度的疫苗中的抗原蛋白，所述标准蛋白的浓度梯度为400μg/ml、200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml。

本发明的技术方案中，优选地，所述的苄醇分离疫苗时所得水相的总体积为4ml±0.1ml。

本发明的技术方案中，优选地，所述的所取疫苗的总体积为9ml。

本发明的技术方案中，优选地，步骤(1)中，准备标准蛋白包括以下步骤：根据bca法蛋白含量测定的浓度，将标准蛋白进行倍比稀释，浓度梯度为：400μg/ml、200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml，1ml/管，都用0.22μm滤膜过滤，备用。

本发明的技术方案中，优选地，步骤(2)中，使用卞醇从疫苗中分离出水相包括以下步骤：1)取9ml疫苗于15ml离心管中，加入1ml苄醇，振荡混匀，进行破乳；2)然后3,000rpm/min，4℃，离心15min，加速破乳；3)离心后得三相，中间相为水相，体积为4ml±0.1ml，用5ml注射器小心吸取中间水相，再使用0.22μm滤膜过滤水相，所得水相储存于1mlep管中，备用。

通过本方法能够实现从油乳剂蛋白亚单位疫苗中快速且高效率的得到抗原蛋白，且不会导致抗原蛋白的变性降解，且该方法简单易于重复；同时通过对得到的抗原蛋白进行一次hplc检测就能够获得油乳剂蛋白亚单位疫苗中抗原蛋白的绝对含量和纯度的结果，节约了成本、劳动力和时间。

因此，本发明不仅解决了油乳剂疫苗中抗原蛋白解离效率低且易变性降解的问题，也解决了成品兽用油乳剂蛋白亚单位疫苗的质检中使用靶动物进行实验的难题。且本发明在油乳剂亚单位疫苗的抗原蛋白含量的定量检测及纯度的检测中准确率能够达到95％以上。

附图说明

图1表示疫苗1(猪流行性腹泻s2’蛋白亚单位疫苗)标准蛋白的标准曲线。

图2表示疫苗2(猪瘟e2蛋白亚单位疫苗)标准蛋白的标准曲线。

具体实施方式

以下将结合附图和实施例对本发明做进一步说明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明。

所用试剂和耗材均为市售产品。

bca蛋白定量试剂盒购自美国thermofisher。

isa201vg购自法国赛比克公司。

白油购自杭州炼油厂。

实施例1：标准蛋白准备

根据bca法蛋白含量测定试剂盒测定的标准蛋白(标准蛋白与相应疫苗中的抗原蛋白相同，即标准蛋白为标定好浓度的疫苗1(猪流行性腹泻s2’蛋白亚单位疫苗)和疫苗2(猪瘟e2蛋白亚单位疫苗)中的抗原蛋白)浓度，将标准蛋白进行倍比稀释，浓度梯度为：400μg/ml、200μg/ml、100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml，1ml/管，都用0.22μm滤膜过滤，备用。

实施例2：疫苗中抗原蛋白制备

(1)取9ml疫苗1和疫苗2于15ml离心管中，并设3个平行，加入1ml苄醇，在涡漩振荡器上6档混匀2min，进行破乳。

(2)3,000rpm，4℃，离心15min，加速破乳。

(3)离心后可得三相，中间相为水相(此相含有抗原蛋白)，体积为4ml±0.1ml，用5ml注射器小心伸入吸取中间水相，使用0.22μm滤膜进行过滤，再使用0.22μm滤膜过滤水相，所得水相储存于1mlep管中，备用。

实施例3：hplc检测及数据分析

3.1hplc检测准备

(1)hplc仪器：waterse2695型液相色谱仪(厂家waterscorporation，四元泵2695，紫外可见光检测器waters2489，二级阵列管检测器waters2998)。

(2)色谱柱选择：凝胶过滤色谱柱(厂家tosohcorporation，型号tskgelg3000swxl，货号08541)。

(3)流动相：20mm磷酸盐，200mmnacl，ph6.8。

3.2hplc检测

(1)仪器状态检查：检查仪器外观，各类缆线连接是否正常，六条管路均充满液体，且各管路在相应的溶液中。

(2)依次打开2695溶剂处系统，2998检测系统和柱温箱电源，自检完成后打开配制的电脑。

(3)清洗：用超纯水清洗系统与色谱柱。

(4)平衡：用配置好的流动相平衡色谱柱。

(5)方法：进样体积50μl，流速0.5ml/min，样品温度5℃，柱温25℃，单波长280nm采样，采样速率2点/秒，标准蛋白运行时间20min，疫苗中抗原蛋白样品运行时间20min。

(6)进样：建立样品组和样品组方法，并将相应样品放入样品盘，开始运行。

(7)数据报告：标准蛋白将在一个固定时间(如进样后15min)出峰，单峰；疫苗中抗原蛋白样品与标准蛋白出峰时间一致，也为单峰。待样品检测完之后，5个标准蛋白根据浓度与峰面积建立标准曲线(r²值应不低于0.99)，各疫苗样品峰面积代入标准曲线，算出相应浓度，并最终保存pdf格式。

(8)关机：用合适的溶剂清洗并保存色谱柱，彻底清洗进样器和系统，最后用100％甲醇充满系统的所有管路。

3.3数据分析

(1)以标准蛋白的浓度为纵坐标，以3.2中检测出来标准蛋白对应的峰面积为横坐标建立标准曲线，由此得到标准曲线的函数及r²，其中r²必须大于0.99；

(2)将3.2中检测出来的水相中的抗原蛋白的峰面积作为(1)中函数的x代入函数中计算得到y值，此y值即为水相中目的蛋白的浓度；

(3)以(2)中水相中目的蛋白的浓度×苄醇分离疫苗时所得水相的总体积(4ml±0.1ml)÷所取疫苗的总体积(9ml)，计算得到疫苗中抗原蛋白的浓度；

(4)根据3.2中检测出来的水相中的抗原蛋白的峰面积占所有峰面积的比例，确定疫苗中抗原蛋白的纯度。

实施例4：两种疫苗检测结果

(1)为更好的说明本发明，本实验室按照实施例1、实施例2和实施例3的方法实施了2种疫苗的蛋白含量和纯度检测，具体疫苗信息如表1所示：

表1

(2)hplc检测标准蛋白的峰面积如表2所示：

表2

以标准蛋白浓度为纵坐标，峰面积为横坐标分别绘制标准曲线，如图1和图2所示。

(3)根据标准曲线以及hplc检测的疫苗中抗原蛋白的峰面积计算疫苗中抗原蛋白的含量，具体结果如表3所示：

表3

(4)疫苗中抗原蛋白纯度检测结果如表4所示：

表4

本发明通过上面的实施例进行举例说明，但是，应当理解，本发明并不限于这里所描述的特殊实例和实施方案。在这里包含这些特殊实例和实施方案的目的在于帮助本领域中的技术人员实践本发明。任何本领域中的技术人员很容易在不脱离本发明精神和范围的情况下进行进一步的改进和完善，因此本发明只受到本发明权利要求的内容和范围的限制，其意图涵盖所有包括在由附录权利要求所限定的本发明精神和范围内的备选方案和等同方案。