一种洋金花药材的鉴别方法与流程

本发明涉及中药材的鉴别与质量控制方法，具体涉及基于共振波导光栅传感器的洋金花药材鉴别方法。

背景技术：

洋金花，又名南洋金花、风茄花、白花曼陀罗，为茄科植物白花曼陀罗Datura metel L.的干燥花。性温、味辛、有毒，归心、肺、肝经。可用于咳嗽哮喘、风湿痹痛、脘腹冷痛和外科麻醉等。东莨菪碱和莨菪碱为其主要功效成分，对毒蕈碱型胆碱受体具有拮抗作用。洋金花主要分布于江苏、安徽、四川、广东、福建等地。其混淆品众多，例如凌霄花、闹羊花、百合花、泡桐花。它们的性状特征相似，但功效却相差甚远。若不能加以区分，则无法保证用药的安全性和有效性。

《中国药典》中对洋金花的鉴别，采用了显微鉴别和理化鉴别两种方式。显微鉴别对洋金花花粉粒、花萼非腺毛等性状都有明确规定。该方法虽然简单，但由于洋金花与其混淆品在很多方面性状相似，显微鉴别的准确性很大程度上依赖于操作者的经验。理化鉴别是以硫酸阿托品和氢溴酸东莨菪碱为对照品，将供试品溶液和对照品溶液分别于同一硅胶G薄层板上展开，对比供试品和对照品在相应的位置上是否显示相同颜色的斑点。此方法具有操作繁杂、通量小和效率低等缺点。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种通量高、专属性强的洋金花药材鉴别方法，能够有效区分洋金花及其7种易混伪品。

本发明的检测原理是细胞膜受体接受刺激会引起细胞内部动态质量再分布，而光学传感器能够检测由于细胞内质量再分布产生的折光率的变化，该变化与产生刺激的小分子的量成正比(图1)。

本发明涉及一种洋金花药材的鉴定方法，其中包括：基于共振波导光栅传感器的二相表型药理鉴别法、HPLC，包括如下五个步骤：

(1)药材的提取、

(2)用共振波导光栅传感器检测药材提取液刺激CHO-M₂细胞所产生的药理表型、

(3)用共振波导光栅传感器检测乙酰胆碱和药材提取液共同刺激CHO-M₂细胞所产生的整合药理表型、

(4)整合第2、3步的药理表型，并与洋金花药材表型进行比对。

(5)基于共振波导光栅传感器的二相表型药理鉴别法与HPLC的联合用于鉴定洋金花药材质量

具体步骤如下：

(1)药材的提取：精密称定1g药材粉末，置锥形瓶中，加入10mL浓度为2mol/L的盐酸溶液，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，滤过，滤渣和滤器用10mL上述盐酸溶液分数次洗涤，合并滤液和洗液，用浓氨试液调节pH值至9，用三氯甲烷振摇提取4次，每次10mL，合并三氯甲烷，回收溶剂至干，残渣用缓冲液溶解，转移至5mL量瓶中，加缓冲液至刻度，摇匀，滤过，取续滤液用于测试。

(2)取20μL CHO-M₂细胞悬液接种在细胞测试板中，放入含有5％二氧化碳、温度为37℃的培养箱中培养14小时。取出细胞测试板，移除培养基，用移液枪向每个孔中加入20μL Hank's平衡盐溶液。将测试板放入Corning EpicBT系统进行信号平衡。1小时后，将基线归零并启动一个新的信号记录程序。记录2分钟后，暂停程序，用排枪将10μL提取液加入每个微孔中，并继续记录1小时。如果加入药材提取液后检测信号超过100pm，则该表型记为1；若信号在-100到100之间，则该表型记为0；若信号小于-100，则该表型记为-1。药材提取液在该阶段所产生的动态质量再分布信号即为第一相表型。

(3)在上述记录程序结束后，重新开始一个程序。信号记录2分钟后暂停程序，用排枪向每个孔中加入10μL浓度为16μM的乙酰胆碱Hank's平衡盐溶液，然后继续记录程序1小时。如果加入乙酰胆碱溶液后信号超过100pm，则该表型记为1；若信号在-100到100之间，则该表型记为0；若信号小于-100，则该表型记为-1。该阶段产生的动态质量再分布信号即为第二相表型。

(4)综合步骤2和3的表型，如果满足(1,0)则为洋金花，其中“1”为步骤2的表型，“0”为步骤3的表型。否则，即为伪品药材。

(5)按照如下条件对洋金花进行HPLC分析，将成分的峰面积或含量与药材活性值进行关联。

流动相A:含有0.0025mol/L庚烷磺酸钠的水溶液，用磷酸调至pH＝5；

流动相B：乙腈。

分离条件为(以B％表示)：

0-13min，16-16％；

13-20min，16-18％；

20-28min，18-18％；

28-30min，18-20％；

30-42min，20-20％；

42-60min，20-25％。

流速为1.0mL/min。

检测波长为215nm。

上述步骤所述CHO-M₂细胞是指能够稳定表达毒蕈碱M₂型胆碱受体的中国仓鼠卵巢细胞。

上述步骤(1)所述的缓冲液为Hank's平衡盐溶液。

上述步骤(2)所述的培养基为含有10％胎牛血清、80U/mL青霉素、0.08mg/mL链霉素、0.4mg/mL遗传霉素和0.08mg/mL博来霉素的HyClone Ham'sF-12营养液。

上述步骤(2)所述的CHO-M₂细胞密度为2,5000个/孔。

上述步骤(2)所述的细胞测试板为Epic 384孔细胞测试板或纤维蛋白覆盖的Epic 384孔细胞测试板。

正品洋金花通过上述方法会产生一个唯一的二相表型。第一相为洋金花与CHO-M₂细胞相互作用产生的药理表型。由于洋金花药材中的复杂成分作用于CHO-M₂细胞表面的某种受体，引起了细胞内动态质量再分布，导致传感器信号的抬升(表型记为“1”)。第二相为洋金花、乙酰胆碱与CHO-M₂细胞三者相互作用产生的药理表型。由于洋金花可以拮抗M₂受体，而乙酰胆碱激动M₂受体，二者作用抵消，使传感器信号基本保持不变(表型记为“0”)。理论上，药物与CHO-M₂细胞在传感器上一共能产生上升(1)、下降(-1)、不变(0)三种表型(如图2)，而基于共振波导光栅传感器的二相表型药理法可能产生3×3＝9种表型。洋金花的专属表型为(1,0)，而其混伪品的表型则对应其他8种表型。以此方法可对洋金花与其混伪品进行鉴别。

本发明涉及一种洋金花药材的鉴定方法，其中包括：基于共振波导光栅传感器的二相表型药理鉴别法、HPLC，包括如下五个步骤：

(1)药材的提取、

(2)用共振波导光栅传感器检测药材提取液刺激CHO-M2细胞所产生的药理表型、

(3)用共振波导光栅传感器检测乙酰胆碱和药材提取液共同刺激CHO-M2细胞所产生的整合药理表型、

(4)整合第2、3步的药理表型，并与洋金花药材表型进行比对、

(5)药材提取物的HPLC分析与谱效关联。

本发明的洋金花药材鉴别方法适用于茄科植物洋金花(包括干品、鲜品、不同产地药材)与其它科同名异物洋金花的区分。本发明的洋金花药材鉴别方法同样也适用于含有茄科植物洋金花药材的人用药品、食品、保健品、化妆品、兽药等各种制成品(包括单方、复方制成品)中是否含有洋金花药材的鉴别。

本发明提供的洋金花药材鉴别方法与现有标准中的显微鉴别方法比较，具有以下优点：

1.具有高通量，可同时对384个样品进行鉴定。避免了显微鉴别单通道耗时长、劳动强度大的弊端。

2.显微鉴别的操作者通常需要具备关于药材显微特征的专业知识，且要对易混药材的细微特征具有辨识能力。而本发明最终产生的表型只是简单类似(1,0)的数字，对经验的依赖性更少，结果的辨识度更高，可以避免误判。

3.该方法可以定量表征洋金花药材质量的优劣，而显微鉴别只能辨别真伪。

附图说明：

图1：共振波导光栅传感器的原理图

图2：基于共振波导光栅传感器产生的3种表型

图3：从H9c2细胞(A)、HAVEC细胞(B)、CHO-M₂细胞(C)中筛选合适的细胞用于洋金花药材的鉴别

图4：共振波导光栅传感器可以检测莨菪碱(A)和东莨菪碱(B)浓度依赖性地拮抗乙酰胆碱对M₂受体的激动作用

图5：20批不同产区洋金花药材的表型

图6：共振波导光栅传感器可以检测洋金花提取液浓度依赖性地拮抗乙酰胆碱对M₂受体的激动作用

图7：基于共振波导光栅传感器的二相表型药理法对洋金花药材及其易混伪品的鉴别

图8：比较洋金花及其易混伪品的显微鉴别特征(花粉粒和非腺毛)

图9：20批不同产区洋金花药材的高效液相色谱图

图10：127个峰组合与洋金花药材活性相关性的聚类分析

图11：东莨菪碱和莨菪碱的定量方程、线性范围、检测限以及定量限

具体实施方式

实施例1：洋金花鉴别法建立的方法学考查

1.实验仪器及材料

电子天平(Sartorius,0.01mg)、Corning Epic BT系统、CHO-M₂细胞、Epic 384孔细胞测试板(Corning 5040)。

2.合适细胞的选取

适用于共振波导光栅传感器检测的细胞需满足两个要求：(1)细胞膜上有丰富的靶标受体；(2)激动剂能够刺激受体并引起细胞内动态质量再分布。在生理系统下，M₂受体主要分布在心脏和血管等部位。因此，心肌细胞系(H9c2)、人主动脉血管内皮细胞(HAVEC)、稳定转染表达M₂受体的中国仓鼠卵巢(CHO-M₂)细胞被用于模型测试。结果如图3所示，在加入10μL浓度为16μM乙酰胆碱后，H9c2和HAVEC没有检测到明显的动态质量再分布信号。而在CHO-M₂细胞上，传感器的信号响应随着乙酰胆碱浓度的增加而梯度增加，表明该细胞是理想的细胞模型。

3.标志性化合物莨菪碱和东莨菪碱的药效评价

莨菪碱和东莨菪碱是洋金花的标志性成分。按照基于共振波导光栅传感器的二相表型药理法操作，可以观察到莨菪碱或东莨菪碱浓度依赖性地拮抗乙酰胆碱引起的细胞内动态质量再分布信号(图4)。

按照如下公式：拮抗率％＝(A_乙酰胆碱－A_待测液)/(A_乙酰胆碱－A_空白)。A_乙酰胆碱为用乙酰胆碱激动受体时所检测到的信号强度，A_空白为加空白溶液时传感器所检测到的信号强度，A_待测液为加入待测液和乙酰胆碱时传感器所检测到的信号强度。

通过对其活性曲线的拟合，可以计算出莨菪碱和东莨菪碱的半数有效浓度(EC₅₀)值分别为0.16μM和0.27μM，表明该发明可以定量表征莨菪碱和东莨菪碱的活性。

实施例2：对来自中国20个产区的洋金花表型进行鉴别。

1.实验仪器及材料

电子天平(Sartorius,0.01mg)、Corning Epic BT系统、CHO-M₂细胞、Epic 384孔细胞测试板(Corning 5040)、20批洋金花。

2.方法和结果

取来自中国不同产区的20批药材(过三号筛)约1g，精密称定，置锥形瓶中，加入10mL浓度为2mol/L的盐酸溶液，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，滤过，滤渣和滤器用10mL的2mol/L盐酸溶液分数次洗涤，合并滤液和洗液，用浓氨试液调节pH值至9，用三氯甲烷振摇提取4次，每次10mL，合并三氯甲烷液，回收溶剂至干，残渣用Hank's平衡盐溶液溶解，转移至5mL量瓶中，加Hank's平衡盐溶液至刻度，摇匀，滤过，取续滤液用于测试。

按照基于共振波导光栅传感器的二相表型药理法，在第一相加入相当于原药材浓度为0.625mg/mL的洋金花提取物溶液，第二相加入16μM乙酰胆碱溶液。结果如图5所示，20批不同产区的洋金花呈现出非常一致的表型(1,0)，即在第一相洋金花提取液能引起动态质量再分布现象，这可能是由于其中包含黄酮类、内酯类等多种成分对CHO-M₂细胞整体作用的结果；在第二相没有动态质量再分布信号，这是由于洋金花提取液的拮抗作用抵消了乙酰胆碱的激动作用。上述结果表明表型(1,0)可以做为不同产区洋金花的共同特征，这是Epic二相表型药理法可以用做洋金花药材鉴别的前提条件。

与莨菪碱和东莨菪碱类似，洋金花同样浓度依赖性地拮抗乙酰胆碱对M₂受体的拮抗作用(图6)。

按照如下公式：拮抗率％＝(A_乙酰胆碱－A_待测液)/(A_乙酰胆碱－A_空白)。A_乙酰胆碱为用乙酰胆碱激动受体时所获得的信号强度，A_空白为加空白溶液时传感器所检测到的信号强度，A_待测液为加入待测液和乙酰胆碱时传感器所检测到的信号强度。通过对其活性曲线的拟合，可以计算出洋金花药材的半数有效浓度(EC₅₀)。结果如表1所示，其中EC₅₀越小的样品表示活性越好，其质量也越好。

表1 20批洋金花药材的来源以及半数有效浓度(EC₅₀)。

实施例3：本发明与中药显微鉴定的比较

1.实验仪器及材料

电子天平(Sartorius,0.01mg)、Corning Epic BT系统、CHO-M₂细胞、Epic 384孔细胞测试板(Corning 5040)、洋金花及其易混伪品。

2.方法和结果

收集洋金花的7种易混伪品包括泡桐花、金银花、山银花、凌霄花、百合花、木槿花、闹羊花。按照实施例2的方法对药材进行提取，配制相当于原药材浓度为0.625mg/mL的测试液。按照基于共振波导光栅传感器的二相表型药理法，对其进行表型测试。结果如图7所示，洋金花的表型为(1,0)。而其他7种药材因为没有拮抗M₂受体的作用，而在第二相表现出“1”的表型，例如(0,1)和(1,1)。通过本发明，洋金花药材与其他混伪品的表型区别显著，证明了该方法在洋金花鉴别方面的有效性。

为了体现该方法的优势，经典的显微鉴别方法被用于对比。结果如图8所示，洋金花的显微特征主要在于：(1)花粉粒类球形或长圆形，表面有条纹状雕纹。(2)非腺毛1～3细胞，壁具疣突。

相比于显微鉴别，本发明的优势体现在：a具有高通量，可同时对384个样品进行鉴定。避免了显微鉴别单通道耗时长、劳动强度大的弊端。b显微鉴别的操作者通常需要具备关于药材显微特征的专业知识，且要对易混药材的细微特征具有辨识能力。而本发明最终产生的表型只是简单类似(1,0)的数字，对经验的依赖性更少，结果的辨识度更高，可以避免误判。c该方法可以定量表征洋金花药材质量的优劣，而显微鉴别只能辨别真伪。

实施例4：基于共振波导光栅传感器的二相表型药理鉴别法与HPLC的联合用于鉴定洋金花药材质量

1.实验仪器及材料

Agilent 1100液相系统、Agilent C₁₈液相色谱柱(250mm×4.6mm,5μm)、庚烷磺酸钠(上海凌峰化学试剂有限公司)、乙腈(Merck)、Milli-Q水纯化系统、磷酸二氢钾(上海凌峰化学试剂有限公司)、磷酸(上海凌峰化学试剂有限公司)、中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版、IBM SPSS数据统计软件19.0、PermutMatrixEN软件。

2.方法和结果

样品的制备：按照实施例2的方法对药材进行提取，采用如下色谱条件对20批不同产地的洋金花药材进行分析。

流动相A:含有0.0025mol/L庚烷磺酸钠的水溶液，用磷酸调至pH＝5；

流动相B：乙腈。

分离条件为(以B％表示)：

0-13min，16-16％；

13-20min，16-18％；

20-28min，18-18％；

28-30min，18-20％；

30-42min，20-20％；

42-60min，20-25％。

流速为1.0mL/min。

检测波长为215nm。

在色谱分析之后，将“AIA”为后缀的数据文件导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版，在多点校正之后，从20批洋金花的色谱图中识别了7个共有峰(图9)。基于这7个色谱峰，按照排列组合算法可以获得127种组合

每个组合的色谱峰面积总和形成一个数据集。20批洋金花药材的EC₅₀值构成第128个数据集。

用IBM SPSS数据统计软件19.0来计算127个组合与第128个活性值之间的皮尔森相关系数，并用PermutMatrixEN软件的Hierarchical分析法对其进行聚类排序。结果如图10所示，对于每一个聚类分析，相关性从左到右依次减小。7个色谱峰与活性的相关性排序为3>2>1>7>6>4>5(图10A)。

通过比较多个峰组合的皮尔森相关系数(图10B-E)，可以发现包含色谱峰2或3的组合排序靠前，而不含峰2和3的组合排序靠后。同时包含峰2和3组合的相关性系数要大于仅包含峰2或3的组合(图10F)。

上述结果表明色谱峰2和3是洋金花药材中与活性密切相关的成分。高分辨质谱分析结果表明峰2和3在正离子模式下的质荷比为304.1548和290.1753，并被最终鉴定为东莨菪碱(C₁₇H₂₁NO₄)和莨菪碱(C₁₇H₂₃NO₃)。它们的定量方程、线性范围、检测限以及定量限如图11所示。

20批不同产地洋金花中东莨菪碱和莨菪碱的含量检测结果如表2所示。

表2 20批洋金花药材中东莨菪碱和莨菪碱的含量(mg/mL)。

按照实施例2的方法对来自中国20个产区的洋金花表型进行鉴别。

上述结果表明，基于共振波导光栅传感器的二相表型药理鉴别法与HPLC的联合使用对建立药材与活性之间的谱效关系具有积极意义。