本发明属于检测方法领域，特别是涉及一种基于再生液优化的表面等离子共振技术同时检测多种环境激素的方法。
背景技术：
近些年来，环境激素作为一种生物机体以外的激素类物质，已经被广泛的应用于人们的日常生活中。虽然环境激素给人们带来了一定的经济效益，但是其在环境和食品中的残留严重的影响着人类身体健康。而且，多数环境激素属于持久性有机污染物，很难降解，并具有一定的蓄积毒性，因此，对于环境激素的监控与分析势在必行。
目前，环境激素大多是通过高效液相色谱、液相色谱-质谱联用以及酶联免疫法(elisa)等方法进行检测分析，但是由于仪器操作技术性强、耗时长、样品前处理繁琐、基质成分复杂、elisa中样品用量浪费以及不能重复使用等缺陷，限制了这些传统方法的应用。因此，需要开发一种更加可靠、高效、灵敏的检测手段。
表面等离子共振生物传感器(surfaceplasmonresonance，spr)，具有无需标记、高灵敏、快速检测等特点，是环境激素检测的理想工具之一。结合免疫检测技术，利用抗体与抗原的结合的原理，对特定的目标物分子进行定性或者定量分析，而且抗体等蛋白类物质具有较大的分子量，能够引起较高的spr响应值变化，可以广泛应用于小分子物质(如双酚a、塑化剂等)的环境激素检测。此外，由于环境激素种类繁多，使得传统的检测过程复杂繁琐，单检测通道的spr传感器无法满足同时检测多种环境激素的要求。因此，迫切需要开发基于spr技术的新型检测方法。
技术实现要素：
针对现有技术中存在的不足，本发明提供一种基于再生液优化的表面等离子共振技术同时检测多种环境激素的方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种基于再生液优化的表面等离子共振技术同时检测多种环境激素的方法，包括以下步骤：
(1)传感芯片表面包被原或抗体的固定：将各环境激素残留组分的包被原或抗体混合至混合液的体积为50-150μl，所述各包被原或抗体在所述混合液中的浓度均为5-20μg/ml，再利用活化酯法(edc/nhs)将所述混合液固定在所述传感芯片表面固定；
(2)标准溶液配制：用0.01-0.1mol/lph为6-8的羟乙基哌嗪乙硫磺酸盐缓冲液(hbs缓冲液)配置各残留组分的标准样品储备液，所述标准样品储备液的浓度均为0.1-1mg/ml；
量取各标准样品储备液，配制其相应的标准原液；用羟乙基哌嗪乙硫磺酸盐缓冲液将标准原液配制成不同浓度的标准溶液与过量的固定浓度的相应抗体或包被原混合孵化，得到不同浓度的待测物混合液；
(3)测试再生液洗脱能力：测试hcl溶液、naoh溶液、氯化镁溶液和甘氨酸-盐酸溶液对于步骤(1)得到的传感芯片表面各环境激素抗体的洗脱情况，选出各组分的最佳再生条件，并对比其再生液洗脱能力的强弱；
(4)建立标准工作曲线：
单组分检测：采用表面等离子共振谱传感器测量，通入50-100μl步骤(2)得到的混合液，记录表面等离子体共振传感器的响应信号变化，绘制标准工作曲线，并进行多项式曲线拟合，获得单组分回归曲线的方程；再依次测得其它环境激素的标准工作曲线及单组分回归曲线的方程；
多组分同时检测：采用表面等离子共振谱传感器测量，将多种步骤(2)制备的标准溶液与过量的抗体或包被原混合孵化，取孵化后的混合液50-100μl，通入传感器，记录下表面等离子体共振传感器总体的响应信号变化；然后按照步骤(3)的的测试结果，依再生液洗脱能力由弱到强的顺序依次进样洗脱，记录每次残留抗体或包被原的响应值变化；根据不同浓度孵化后的混合液及其相应再生后残留抗体或包被原的响应信号值绘制标准工作曲线，并进行多项式曲线拟合，获得多组分回归曲线方程；
(5)定量检测：对于未知含量的含多种环境激素的未知样品进行同时检测，向所述未知样品的待测液中分别加入过量的抗体或包被原，混合孵化后进样，记录总体的响应值变化；按照再生液洗脱能力由弱到强的顺序依次进样洗脱，记录芯片表面每次残留抗体或包被原的响应值变化；将残留抗体或包被原的响应值代入步骤(4)得到的多组分检测的标准工作曲线以及相应的单组分检测标准工作曲线，计算各环境激素的浓度值；依次类推，实现对于环境激素的定量检测；
(6)通入0.01-0.02mol/l、ph为1.2-2.5的甘氨酸-盐酸缓冲溶液使芯片再生，再生后的芯片用于下次测量。
优选的是，步骤(2)中，所述的ph值为7.4。
优选的是，步骤(5)中，标准样品储备液与过量抗体或包被原的混合孵化时间为5-10分钟。
在上述方法的步骤(1)中，当传感芯片表面固定的是包被原的混合液时，在后续步骤中进行混合孵化时就采用抗体。反之，在上述方法的步骤(1)中，当传感芯片表面固定的是抗体的混合液时，在后续步骤中进行混合孵化时就采用包被原。
通过本发明的方法，同一芯片的单通道能够同时连接多种包被原。而且，可以采用不同洗脱强度的再生液对芯片梯度洗脱，同时实现环境激素的检测与芯片再生。根据单一检测曲线方程以及同时检测的曲线方程，可以实现多种环境激素的同时检测。所述步骤(4)和(5)中通入过量的抗体溶液，利用抗体结合芯片的方式，提高表面等离子体共振传感器响应值，适用于测量响应信号较小的小分子量环境激素，其分子量可<1000da。
本发明采用spr传感器梯度再生的方法，将再生液按照由弱到强顺序，梯度洗脱传感器表面吸附的不同结合强度的抗体，基于spr实时监控的特点，分析再生液洗脱后芯片表面抗体与响应值变化的情况，可同时检测多种环境激素。
本发明利用免疫抑制的方法，将待测环境激素与过量的抗体预混，混合液中未反应的抗体与传感器芯片表面的包被原发生特异性结合，引起信号变化；若待测样品中目标分子少，则混合液中剩余的未反应的抗体较多，使得芯片表面吸附的抗体多，此时引起的表面等离子体共振响应信号越大，反之则越小。由于抗体的响应值变化可反映出待测目标分子的浓度变化，而抗体的分子量较大，其引起的响应值变化较大，因此，可实现小分子物质的高灵敏检测。而且，当对多种待测环境激素检测时，相应抗体同时结合在芯片表面，通过spr获得总体的响应值变化；根据不同抗原抗体间结合力的差异，可以通过利用不同强度的洗脱溶液梯度再生的方式，按着再生液由弱到强的顺序进行洗脱，逐一递推，最后通过spr传感器的实时监控实现多种环境激素的快速和同时检测。
本发明的优点及有益效果是：
1、本发明采用免疫抑制的方法，将包被原修饰在芯片表面，大大提高了传感芯片的使用寿命，而且解决了spr检测小分子量物质的响应值小、灵敏度低等问题，实现了小分子环境激素的高灵敏检测；
2、本发明采用再生液梯度洗脱的方式，实现了在表面等离子体共振传感器单一检测通道内，同时检测多种环境激素，相比单一物质的检测，大大提高了样品检测效率，缩短了样品检测时间；
3、本发明不仅能够实现传统单通道spr传感器多样检测的目的，而且可以进一步提高多通道检测的通量，同时提高了传感芯片的使用效率，降低了环境激素的检测成本。
具体实施方式
本发明通过以下实施例进一步详述。需要说明的是：下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
选择两种典型环境激素为检测对象，分别为双酚a和邻苯二甲酸酯(dehp)。
选择芯片修饰分子为两种目标分子的包被原，即牛血清白蛋白-双酚a和牛血清白蛋白-邻苯二甲酸酯。
选择的识别分子为小鼠抗体，即双酚a抗体和邻苯二甲酸酯抗体。
具体操作步骤如下：
(1)传感器表面包被原固定：首先利用edc/nhs法活化芯片表面羧基，然后将双酚a和邻苯二甲酸酯的包被原混合，使总体积为150μl，两种包被原在所述混合液中的浓度均为20μg/ml，然后以30μl/min的速度通入传感器的检测通道，将两种包被原的混合液直接修饰在传感器芯片表面，最后利用ph为8.5的乙醇胺封闭。
(2)标准溶液配制：分别称取双酚a和邻苯二甲酸酯2种标准品10mg，溶解于0.01mol/l、ph值为7.4的hbs缓冲液，定容至10ml，即为1mg/ml的标准贮备液；并且分别量取2种标准贮备液，配制2种残留组分的标准原液分别为100ng/ml；
进行单组分检测时，取100μg/ml双酚a抗体10μl，与不同体积的双酚a标准原液混合，用hbs缓冲液混合液稀释至100μl，最终得到混合液中双酚a浓度依次为0、5、10、20、30、40ng/ml；按照类似的方法，取100μg/ml邻苯二甲酸酯抗体10μl，与不同体积的邻苯二甲酸酯标准原液混合，用hbs缓冲液混合液稀释至100μl，最终得到混合液中邻苯二甲酸酯浓度依次为0、5、10、20、30、40ng/ml。
两种样品同时检测时，取10μl双酚a抗体(100μg/ml)，10μl邻苯二甲酸酯抗体(10μg/ml)与不同体积的双酚a、邻苯二甲酸酯标准溶液混合，用hbs缓冲液混合液稀释至100μl，其中双酚a、邻苯二甲酸酯浓度分别为0、5、10、20、30、40ng/ml，备用。
(3)再生液的筛选：对以下再生溶液进行了优化选择，不同ph值的0.01mol/l的甘氨酸-盐酸溶液(gly-hcl，ph值分别为1.2、1.5、2.0、2.5)，浓度分别为0.015mol/l、0.025mol/l、0.03mol/l、0.035mol/l和0.05mol/l的naoh溶液，5mol/l的氯化镁溶液(mgcl2)以及0.1mol/l的hcl溶液；实验中的样品添加时流速设定为30μl/min，分别测试，观察各自的再生效果，选出最佳再生条件，并判断两种再生液洗脱能力的强弱。
(4)标准曲线绘制：
首先，单组分的检测，通入浓度为0、5、10、20、30、40ng/ml双酚a标准溶液与抗体混合液100μl，采用表面等离子共振谱传感器测量，记录下表面等离子体共振传感器信号变化，绘制标准工作曲线，并进行多项式曲线拟合，获得单组分回归曲线的方程；再依次通入浓度为0、5、10、20、30、40ng/ml邻苯二甲酸酯混合液100μl，采用表面等离子共振谱传感器测量，记录下表面等离子体共振传感器信号变化，绘制标准工作曲线，并进行多项式曲线拟合，获得单组分回归曲线的方程。
其次，两种样品的同时检测，将双酚a和邻苯二甲酸酯的标准溶液、相应抗体充分混合孵化，通入100μl待测混合样品，记录下表面等离子体共振传感器总体的响应信号变化(t)；然后利用洗脱能力较弱的再生液(naoh)进行洗脱，其中邻苯二甲酸酯抗体被彻底洗脱掉，双酚a抗体依然残留芯片表面，因而存在一定的响应信号变化(r)；随着混合液中双酚a浓度的变化，响应值r也会随之改变，记录双酚a标准溶液浓度及其响应值r的关系，绘制标准工作曲线，并进行多项式曲线拟合，获得多组分回归曲线方程。
(5)通入0.01mol/l(ph为1.2)甘氨酸-盐酸溶液，将芯片表面残留的抗体洗脱，完成传感芯片再生，备用。
(6)传感芯片再生后，向实际未知浓度待测样品(未知样品)加入10μl双酚a抗体(100μg/ml)，10μl邻苯二甲酸酯抗体(100μg/ml)，混合孵化；通入表面等离子体共振传感器中，记录总体响应值变化(t)，然后用naoh溶液再生，获得残留双酚a抗体响应值(r)，将r代入其相应的曲线方程，获得双酚a组分含量；然后将双酚a浓度代入到其单组分检测时的标准曲线方程，获得双酚a的响应值(c)；利用总体响应值t与双酚a响应值c的差值得到邻苯二甲酸酯响应值(g)，然后将g代入邻苯二甲酸酯单一检测时的标准曲线，从而确定邻苯二甲酸酯的含量，检测限可达ng/ml级。
(7)再次通入0.01mol/l(ph为1.2)甘氨酸-盐酸溶液，将芯片表面残留的抗体洗脱，完成传感芯片再生，用于下次测量。
根据实施例的方法进行检测样品，与现有表面等离子体检测技术相比，检测效率提高了2倍以上，检测成本降低了2倍以上，时间缩短2倍以上，芯片可重复使用几百次，采用本发明的方法解决了传统spr单一通道不能多重检测的难题，并且可应用于准确检测双酚a、邻苯二甲酸酯等小分子量(<1000da)物质。
本发明为了叙述的准确和方便，在实施例中以双酚a、邻苯二甲酸酯为例进行详细描述，但本发明同样适用于其他环境激素的测定，如二乙基人造雌性激素、二恶英、有机锡等环境激素的精确检测和定性分析，因此上述内容均在本发明保护范围之内，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。