一种基于手机USB‑OTG接口的电化学发光生化检测系统及方法与流程

本发明涉及一种基于手机usb-otg接口的电化学发光生化检测系统及方法，尤其实现了手机平台上电压激励与图像分析一体化的电化学发光分析。

背景技术：

usb具有热插拔的性质，并且方便携带和使用，同时usb标准也是一个开放标准，它支持不同厂商的不同设备可以在同一设备上使用，具有更加广泛的应用场景，支持不同设备。基于以上特点，usb接口得到了迅速的普及。但是标准的usb采用的是主从结构，即一个主设备连接一个或多个从设备，在一个传输体系中，数据传输只能发生在主设备和从设备之间，不能发生在从设备和从设备之间。otg协议作为usb的补充协议后可以实现从设备与从设备之间的联接。通过利用otg协议，给手机连上otg外设，可以实现外设与手机间的双向通讯。传统的手机平台上的电化学发光分析，主要利用手机的图像分析功能，电压激励还需外接电化学工作站提供，不能完全意义上称为基于手机的电化学发光，因此手机平台上电压激励与图像分析一体化的电化学发光分析的研究具有深远的意义。本发明提出一种基于手机usb-otg接口的电化学发光生化检测系统及方法，并将该技术应用于bsa以及凝血酶的电化学发光检测过程中，具有装置便携通用，稳定性好，操作便捷等优点，能够适应即时生化检测的要求。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种基于手机usb-otg接口的电化学发光生化检测系统及方法，尤其实现了手机平台上电压激励与图像分析一体化的电化学发光分析。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种基于手机usb-otg接口的电化学发光生化检测系统，该系统包括电化学发光捕获分析系统、电化学发光可调激励源系统和电化学发光反应装置。

所述电化学发光捕获分析系统包括：带有摄像头的手机和电化学发光分析单元；摄像头捕获电化学发光图像，电化学发光分析单元对电化学发光图像进行提取、切割、灰度处理以及定量分析，最终获得电化学发光分析结果。

所述电化学发光可调激励源系统包括：usb-otg手机端接口、usb-otg外接电路接口、工作电极接口和对电极接口；在利用手机提供电压激励时，usb-otg手机端接口连接在手机的usb端口，经过连接线连接usb-otg外接电路接口；将usb-otg外接电路接口的电源线和地线分别作为正极和负极，顺序接入过流保护电路、阻抗式分压电路和稳压电路，通过稳压电路后的正极连接工作电极接口，负极连接对电极接口。工作电极接口连接ito导电玻璃，对电极接口连接铂丝环对电极。此时工作电极接口和对电极接口处可以稳定的输出1～4v电压用于激发电化学发光。

所述电化学发光反应装置包括电化学发光反应槽和电化学发光反应支撑密封底座，所述电化学发光反应槽具有中通的圆台形反应腔体；电化学发光反应支撑密封底座的横截面为凹形结构，凹槽内放置ito导电玻璃，ito导电玻璃的上部放置密封圈，实现与电化学发光反应槽的密封连接；反应腔体内放置铂丝环对电极，并加入电化学发光的共反应剂体系以及对应的检测物质，实现稳定的电化学发光检测。

一种利用上述系统进行电化学发光生化检测方法，该方法包括以下步骤：

(1)电化学发光共反应剂体系选择及优化：选择发光物质、共反应剂；确定共反应剂浓度、发光物质与共反应剂用量配比；制备标准浓度的发光物质，在反应腔体内加入电化学发光的共反应剂体系，确定最优发光物质浓度。

(2)电极预处理：裁剪ito导电玻璃，分别使用丙酮、乙醇与水超声清洗三次，最后用大量超纯水冲洗，氦气吹干，用作工作电极；铂丝环使用超纯水冲洗三次，用作对电极。

(3)电压选择：利用电化学工作站，实现电化学发光激励电压的选择，将步骤(2)处理好的ito导电玻璃与电化学工作站的工作电极端口相连，铂丝环与电化学工作站的对电极端口相连，电化学工作站选择循环伏安法模式，施加1.5v～3.3v电压，记录电流信号，电流信号从无到有证明电化学发光反应的产生。

(4)ito电极的生物特异性修饰：根据检测目标物质的特性，在ito表面修饰一层特异性敏感膜。

(5)将usb-otg手机端接口连接在手机的usb端口，将手机的5v电压在工作电极接口和对电极接口处稳定的输出1～4v电压，从而激发电化学发光。

(6)手机摄像头捕获电化学发光图像。

(7)电化学发光分析单元对电化学发光图像进行提取、切割、灰度处理等预处理以及电化学发光定量分析，最终获得电化学发光分析结果；所述电化学发光定量分析具体为：将灰度处理后的图像进行灰度分析，计算图像中像素点的灰度平均值，利用最小二乘法计算灰度标定曲线；将灰度处理后的图像进行rgb分析，计算图像中像素点的r平均值，利用最小二乘法计算r标定曲线；将灰度处理后的图像进行rgb分析，计算图像中像素点的g平均值，利用最小二乘法计算g标定曲线；将灰度处理后的图像进行rgb分析，计算图像中像素点的b平均值，利用最小二乘法计算b标定曲线。

(8)将待测物质置于反应腔体内，重复步骤(5)和(6)得到电化学发光图像，经与步骤(7)相同的预处理后，根据四个标定曲线，得到待测物质浓度。

进一步地，该方法可用于基于bsa电化学发光检测；所述共反应剂体系具体为：三联吡啶钌为发光物质，三丙胺为共反应剂，其浓度为1m；三联吡啶钌与三丙胺的体积比为1：9；最优的三联吡啶钌浓度为10mm；最优激励电压为2.5v。该方法包括以下步骤：

(a)ito电极的anti-bsa修饰：剪取面积为1cm²的硝酸纤维素薄膜，溶于1ml的甲醇中，搅拌，待硝酸纤维素薄膜完全溶解后；取10ul的溶解硝酸纤维素薄膜滴于ito导电玻璃的导电面，并在中间均匀铺成面积为3cm×3cm的正方形修饰区域，静置1分钟待甲醇挥发后，在ito中间区域形成硝酸纤维素薄膜修饰的敏感区域；在该区域滴加200ul的1mm的anti-bsa，并均匀铺成面积为3cm×3cm的正方形修饰区域，静置30分钟，利用硝酸纤维素薄膜的吸附作用，在ito电极表面修饰上anti-bsa，在后续的电化学发光反应进行中可以特异性的与bsa反应，引起发光强度的变化。

(b)标准溶液制配：配制浓度分别为10um，20um，50um，100um，200um，500um和1000um的bsa标准溶液，溶剂为去离子水。

(c)基于手机的bsa电化学发光检测：在反应腔体内加入200ul的10um的bsa标准溶液，反应10分钟，再加入200ul的最优浓度的10mm三联吡啶钌与1800ul的1m的三丙胺作为电化学发光的共反应剂体系，然后利用电化学发光可调激励源系统提供最优2.5v的激励电压，最后按照步骤(7)对电化学发光结果进行处理和分析；使用相同的方法，在手机上对20um，50um，100um，200um，500um和1000um的bsa标准溶液进行电化学发光结果处理和分析；最后建立bsa浓度与灰度，以及bsa浓度与rgb之间的对应关系曲线。

(d)将待测浓度的bsa溶液根据步骤(c)建立的标准曲线中，得到待测bsa溶液的浓度。

进一步地，该方法可用于凝血酶电化学发光检测，所述共反应剂体系具体为：三联吡啶钌为发光物质，三丙胺为共反应剂，其浓度为1m；三联吡啶钌与三丙胺的体积比为1：9；最优的三联吡啶钌浓度为10mm；最优激励电压为2.5v。该方法包括以下步骤：

(a)ito电极的凝血酶特异性响应多肽修饰：首先在ito中间区域形成硝酸纤维素薄膜修饰的敏感区域；然后在该区域滴加200ul的10^-5m的凝血酶特异性响应多肽(cys-leu-val-pro-arg-gly-ser-cys)，并均匀铺成面积为3cm×3cm的正方形修饰区域，静置30分钟，在ito电极表面修饰上凝血酶特异性响应多肽，在后续的电化学发光反应进行中可以特异性的与凝血酶反应，引起发光强度的变化。

(b)标准溶液制配：配制浓度分别为10^-9m，10^-8m，10^-7m，10^-6m，和10^-5m的凝血酶标准溶液，溶剂为去离子水。

(c)基于手机的凝血酶电化学发光检测：在手机上对10^-9m，10^-8m，10^-7m，10^-6m，和10^-5m的凝血酶标准溶液进行电化学发光结果处理和分析；最后建立凝血酶浓度与灰度，以及凝血酶浓度与rgb之间的对应关系曲线。

(d)将待测浓度的凝血酶溶液根据步骤(c)建立的标准曲线中，得到待测凝血酶溶液的浓度。

本发明的有益效果是：

1、实现了激励与分析一体化的手机电化学发光分析，并将该技术应用于bsa以及凝血酶的电化学发光检测过程中，具有装置便携通用，稳定性好，操作便捷等优点，能够适应即时生化检测的要求。

2、本发明首次利用手机usb-otg接口实现了电化学发光激励源的设计，该设计利用手机usb-otg接口输出的5v电压经过过流保护电路、阻抗式分压电路和稳压电路后，可以稳定的输出1～4v电压，用于激发电化学发光，同时该电化学发光强度可以被手机摄像头捕获。

3、开发了电化学发光分析单元，用于电化学发光的定量分析；在实际bsa的电化学发光分析过程中，建立了发光强度与灰度值的高匹配度；在实际凝血酶的电化学发光分析过程中，建立了发光强度与灰度值以及r参数的高匹配度；证明了三联吡啶钌、三丙胺电化学发光共反应剂体系中，发光图像的灰度值和rgb参量中的r参数具有更好的浓度依赖性，g、b参数的与电化学发光强度对应关系较弱。

4、构建了基于ito导电玻璃的电化学发光分析，由于其良好的透光性，减少了发光信号在传递过程中的损耗；同时其良好的导电性为电化学发光的产生提供了必要条件；此外其光洁平滑的表面更有利于表面的修饰，减少测试过程中的环境误差；最后ito导电玻璃，可一次性使用，环境污染小，更利于便携式电化学发光生物传感器的开发。

5、通过硝酸纤维薄膜，在电极表面形成稳定性好的功能膜，具有重复性高、鲁棒性好等优点，简化修饰过程，实现了无毒、绿色、以及高效的修饰过程。

6、该方法对使用条件的要求小，操作简便、检测稳定性好、通用性强、易于推广使用。

附图说明

图1是基于手机usb-otg接口的电化学发光检测系统框架图；

图2是usb-otg接口内部线路图；

图3(a)是电化学发光反应装置一个角度结构图；

图3(b)是电化学发光反应装置另一个角度结构图；

图4是基于手机电化学发光分析软件设计流程图；

图5是电化学发光在施加不同电压下对应电流结果；

图6是手机捕获并处理所得的不同浓度下三联吡啶钌发光结果图；

图7是手机软件分析的不同浓度下三联吡啶钌发光灰度结果图；

图8是手机软件分析的不同浓度下三联吡啶钌发光r结果图；

图9是手机软件分析的不同浓度下三联吡啶钌发光g结果图；

图10是手机软件分析的不同浓度下三联吡啶钌发光b结果图；

图11是手机捕获并处理所得的不同浓度下bsa发光结果图；

图12是手机软件分析的不同浓度下bsa发光灰度结果图；

图13是手机软件分析的不同浓度下bsa发光r结果图；

图14是手机软件分析的不同浓度下bsa发光g结果图；

图15是手机软件分析的不同浓度下bsa发光b结果图；

图16是手机捕获并处理所得的不同浓度下凝血酶发光结果图；

图17是手机软件分析的不同浓度下凝血酶发光灰度结果图；

图18是手机软件分析的不同浓度下凝血酶发光r结果图；

图19是手机软件分析的不同浓度下凝血酶发光g结果图；

图20是手机软件分析的不同浓度下凝血酶发光b结果图。

图中，电化学发光可调激励源系统1、电化学发光可调激励源系统2、摄像头3、电化学发光分析单元4、usb-otg手机端接口5、连接线6、usb-otg外接电路接口7、过流保护电路8、阻抗式分压电路9、稳压电路10、工作电极接口11、对电极接口12、usb-otg手机端接口内部端口13、usb-otg外接电路接口内部端口14、电化学发光反应槽15、电化学发光反应支撑密封底座16、反应腔体17、凹槽18。

具体实施方式

以下结合附图及具体实施例对本发明作详细描述，但并不是限制本发明。

本发明提供的一种基于手机usb-otg接口的电化学发光生化检测系统，该系统包括电化学发光捕获分析系统(1)、电化学发光可调激励源系统(2)和电化学发光反应装置。

所述电化学发光捕获分析系统(1)包括：如图1所示，带有摄像头(3)的手机和电化学发光分析单元(4)；摄像头(3)捕获电化学发光图像，电化学发光分析单元(4)对电化学发光图像进行提取、切割、灰度处理、以及定量分析，最终获得电化学发光分析结果。

所述电化学发光可调激励源系统(2)，如图1所示，包括usb-otg手机端接口(5)、usb-otg外接电路接口(7)、工作电极接口(11)和对电极接口(12)；在利用手机提供电压激励时，usb-otg手机端接口(5)连接在手机的usb端口，经过连接线(6)连接usb-otg外接电路接口(7)；将usb-otg外接电路接口(7)的电源线和地线分别作为正极和负极(图2所示)，顺序接入过流保护电路(8)、阻抗式分压电路(9)和稳压电路(10)，通过稳压电路(10)后的正极连接工作电极接口(11)，负极连接对电极接口(12)。工作电极接口(11)连接ito导电玻璃，对电极接口(12)连接铂丝环对电极。此时工作电极接口(11)和对电极接口(12)处可以稳定的输出1～4v电压用于激发电化学发光。

所述电化学发光反应装置包括电化学发光反应槽(15)和电化学发光反应支撑密封底座(16)(图3所示)，所述电化学发光反应槽(15)具有中通的圆台形反应腔体(17)；电化学发光反应支撑密封底座(16)的横截面为凹形结构，凹槽(18)内放置ito导电玻璃，ito导电玻璃的上部放置密封圈，实现与电化学发光反应槽(15)的密封连接；反应腔体(17)内放置铂丝环对电极，并加入电化学发光的共反应剂体系以及对应的检测物质，实现稳定的电化学发光检测。

优选地，铂丝环对电极的直径为2.5cm，反应腔体(17)底部圆的直径为2cm，铂丝环对电极与ito导电玻璃的垂直距离为4mm～8mm。

一种基于手机usb-otg接口的电化学发光生化检测系统，该方法包括以下步骤：

(1)电化学发光共反应剂体系选择及优化：选择发光物质、共反应剂；确定共反应剂浓度、发光物质与共反应剂用量配比；制备标准浓度的发光物质，在反应腔体(17)内加入电化学发光的共反应剂体系，确定最优发光物质浓度。

(2)电极预处理：使用玻璃切割器将10cm×10cm的ito导电玻璃裁成3cm×5cm，，分别使用丙酮、乙醇与水超声清洗三次，最后用大量超纯水冲洗，氦气吹干，用作工作电极；直径为2.5cm的铂丝环使用超纯水冲洗三次，用作对电极。

(3)电压选择：利用电化学工作站，实现电化学发光激励电压的选择，将步骤(2)中处理好ito导电玻璃通过导线与电化学工作站的工作电极端口相连，铂丝环通过导线与电化学工作站的对电极端口相连。如图5所示，电化学工作站选择循环伏安法模式，施加1.5v～3.3v电压，记录电流信号，电流信号从无到有证明电化学发光反应的产生。

(4)ito电极的生物特异性修饰：根据检测目标物质的特性，在ito表面修饰一层特异性敏感膜。

(5)将usb-otg手机端接口(5)连接在手机的usb端口，将手机的5v电压在工作电极接口(11)和对电极接口(12)处稳定的输出1～4v电压，从而激发电化学发光。

(6)手机摄像头(3)捕获电化学发光图像。

(7)电化学发光分析单元(4)对电化学发光图像进行提取、切割、灰度处理等预处理以及电化学发光定量分析，最终获得电化学发光分析结果(图4所示)；所述电化学发光定量分析具体为：将灰度处理后的图像进行灰度分析，计算图像中像素点的灰度平均值，利用最小二乘法计算灰度标定曲线；将灰度处理后的图像进行rgb分析，计算图像中像素点的r平均值，利用最小二乘法计算r标定曲线；将灰度处理后的图像进行rgb分析，计算图像中像素点的g平均值，利用最小二乘法计算g标定曲线；将灰度处理后的图像进行rgb分析，计算图像中像素点的b平均值，利用最小二乘法计算b标定曲线。

(8)将待测物质置于反应腔体(17)内，重复步骤(5)和(6)得到电化学发光图像，经与步骤(7)相同的预处理后，根据四个标定曲线，得到待测物质浓度。

一种利用上述系统进行电化学发光生化检测方法，所述步骤(1)中，共反应剂体系具体为：三联吡啶钌为发光物质，三丙胺为共反应剂，其浓度为1m；三联吡啶钌与三丙胺的体积比为1：9；所述步骤(3)中最优激励电压为2.5v。该方法包括以下步骤：

(a)标准溶液制配：配制浓度分别为0.1mm，1mm，2mm，3mm，5mm，7mm，10mm和20mm的三联吡啶钌标准溶液，溶剂为去离子水。

(b)不同浓度三联吡啶钌电化学发光检测：在反应腔体(17)内加入200ul的0.1mm三联吡啶钌与1800ul的1m的三丙胺作为电化学发光的共反应剂体系，然后利用基于手机的电化学发光可调激励源系统(2)提供由步骤(3)选出的最优2.5v的激励电压，最后按照步骤(7)对电化学发光结果进行处理和分析；使用相同的方法，在手机上对1mm，2mm，3mm，5mm，7mm，10mm和20mm的三联吡啶钌标准溶液进行电化学发光结果处理和分析；最后建立三联吡啶钌浓度与灰度(图6、7所示)，以及三联吡啶钌浓度与rgb之间的对应关系曲线(图8、9、10所示)。

(c)根据步骤(2)，通过对发光图像的分析，找到发光强度最大时对应的浓度，以确定最优的发光物质浓度。

实施例1：基于手机的bsa电化学发光检测，具体包括以下步骤：

(a)ito电极的anti-bsa修饰：剪取面积为1cm²的硝酸纤维素薄膜，溶于1ml的甲醇中，搅拌，待硝酸纤维素薄膜完全溶解后；取10ul的溶解硝酸纤维素薄膜滴于ito导电玻璃的导电面，并在中间均匀铺成面积为3cm×3cm的正方形修饰区域，静置1分钟待甲醇挥发后，在ito中间区域形成硝酸纤维素薄膜修饰的敏感区域；在该区域滴加200ul的1mm的anti-bsa，并均匀铺成面积为3cm×3cm的正方形修饰区域，静置30分钟，利用硝酸纤维素薄膜的吸附作用，在ito电极表面修饰上anti-bsa，在后续的电化学发光反应进行中可以特异性的与bsa反应，引起发光强度的变化。

(b)标准溶液制配：配制浓度分别为10um，20um，50um，100um，200um，500um和1000um的bsa标准溶液，溶剂为去离子水。

(c)基于手机的bsa电化学发光检测：在反应腔体(17)内加入200ul的10um的bsa标准溶液，反应10分钟，再加入200ul的由步骤(3)选出的最优浓度的10mm三联吡啶钌与1800ul的1m的三丙胺作为电化学发光的共反应剂体系，然后利用基于手机的电化学发光可调激励源系统(2)提供由步骤(3)选出的最优2.5v的激励电压，最后按照步骤(7)对电化学发光结果进行处理和分析；使用相同的方法，在手机上对20um，50um，100um，200um，500um和1000um的bsa标准溶液进行电化学发光结果处理和分析；最后建立bsa浓度与灰度(图11、12所示)，以及bsa浓度与rgb之间的对应关系曲线(图13、14、15所示)。

(d)将待测浓度的bsa溶液根据步骤(c)建立的标准曲线中，得到待测bsa溶液的浓度。

实施例2：基于手机的凝血酶电化学发光检测，具体包括以下步骤：

(a)ito电极的凝血酶特异性响应多肽修饰：剪取面积为1cm²的硝酸纤维素薄膜，溶于1ml的甲醇中，搅拌，待硝酸纤维素薄膜完全溶解后；取10ul的溶解硝酸纤维素薄膜滴于ito导电玻璃的导电面，并在中间均匀铺成面积为3cm×3cm的正方形修饰区域，静置1分钟待甲醇挥发后，在ito中间区域形成硝酸纤维素薄膜修饰的敏感区域；在该区域滴加200ul的10^-5m的凝血酶特异性响应多肽(cys-leu-val-pro-arg-gly-ser-cys)，并均匀铺成面积为3cm×3cm的正方形修饰区域，静置30分钟，利用硝酸纤维素薄膜的吸附作用，在ito电极表面修饰上凝血酶特异性响应多肽，在后续的电化学发光反应进行中可以特异性的与凝血酶反应，引起发光强度的变化。

(b)标准溶液制配：配制浓度分别为10^-9m，10^-8m，10^-7m，10^-6m，和10^-5m的凝血酶标准溶液，溶剂为去离子水。

(c)基于手机的凝血酶电化学发光检测：在反应腔体(17)内加入200ul的10^-9m的凝血酶标准溶液，反应10分钟，再加入200ul的由步骤(3)选出的最优浓度的10mm三联吡啶钌与1800ul的1m的三丙胺作为电化学发光的共反应剂体系，然后利用基于手机的电化学发光可调激励源系统(2)提供由步骤(3)选出的最优2.5v的激励电压，最后按照步骤(7)对电化学发光结果进行处理和分析；使用相同的方法，在手机上对10^-8m，10^-7m，10^-6m，和10^-5m的凝血酶标准溶液进行电化学发光结果处理和分析；最后建立凝血酶浓度与灰度(图16、17所示)，以及凝血酶浓度与rgb之间的对应关系曲线(图18、19、20所示)。

(d)将待测浓度的凝血酶溶液根据步骤(c)建立的标准曲线中，得到待测凝血酶溶液的浓度。