一种提高无机硒形态分析回收率的方法与流程

本发明涉及一种提高无机硒形态分析回收率的方法。

背景技术：

随着有机硒资源的开发利用和人们对无机硒毒性的认识，药品、保健品中有机硒的含量和无机硒的限量成为评价产品质量的重要指标，现行国家标准中仅规定总硒含量的检测方法，未分析硒的形态，因此不能正确评价富硒产品的补硒效果。有些地方标准中制定了有机硒的检测方法，但均采用先提取分离有机硒和无机硒，再用测总硒的方法测定无机硒，前处理方法繁杂，且分离、提取不完全会影响结果的准确性。我们在研究中发现，聚硒植物碎米荠的总硒含量高达3000mg/kg以上，按dbs42/002-2014的方法测定无机硒高达50％以上，而采用hplc-hg-afs法测定用环己烷萃取前、后水相中的成分，主要是硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸，在萃取前后变化不大；无机硒非常少，se(iv)未检出，se(vi)需要在进样50μl才能检测出来，因此dbs42/002-2014不适宜于碎米荠中无机硒的测定，以碎米荠为原料开发的硒蛋白粉、硒蛋白片等也存在同样的问题，给企业带来很大的困惑。硒的形态分析方法是近年来发展的方向，能够有效分离有机硒和无机硒，但由于有机硒形态复杂，很多成分还没有标准物质，无法定性定量，直接测定有机硒的形态难度极大，方法还不成熟，而随着hplc-icp-ms及hplc-hg-afs联用技术的发展，无机硒中se(iv)和se(vi)测定的仪器方法灵敏度高，适用性强，能克服采用总硒测定无机硒方法的不足。

硒的形态分析技术是评价富硒产品价值的有效方法，现阶段，无机硒的测定方法、硒代氨基酸的测定方法等均在制定行业或地方标准，在研究样品中的无机硒的测定方法时发现：在进行回收率验证时，富硒茶、富硒米、富硒食用菌粉压片等样品浸提液中没有无机硒的峰，加入se(iv)、se(vi)标样后，仍然无峰，其原因是由于有机物对测定的干扰，致使样品中无机硒的回收率不高。如果不能提高回收率，产品中添加的无机硒不能被检出，将是开发的方法在实际应用中的一个大漏洞，标准将不适宜于复杂成分的富硒产品的检测。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种提高无机硒形态分析回收率的方法。

本发明一种提高无机硒形态分析回收率的方法，其特征在于包含以下步骤：

a.称取样品：称取样品，加入硫酸铜溶液，用kh2po4溶液定容；

b.振荡浸提：将定容液放于超级恒温振荡器上振荡浸提30min；

c.滤膜过滤：将振荡浸提液用0.45μm滤膜过滤；

d.测定：将过滤液用高效液相色谱-氢化物原子荧光联用仪测定无机硒。

本发明一种提高无机硒形态分析回收率的方法，其特征在于包含以下步骤：

a.称取样品：称取样品0.10g，加入0.1mg·ml^-1的硫酸铜溶液250μl，用0.1mol·l^-1kh2po4溶液定容至3ml；

b.振荡浸提：将定容液放于超级恒温振荡器上在70℃,1500rmp条件下振荡浸提30min；

c.滤膜过滤：将振荡浸提液用0.45μm滤膜过滤；

d.测定：将过滤液用高效液相色谱-氢化物原子荧光联用仪测定无机硒。

本发明亚硒酸根离子[se(iv)]和硒酸根离子[se(vi)]回收率在94.77％-116.40％之间，满足分析检测的要求，以此可以制定食品、土壤中无机硒的测定方法标准。

本发明一种提高无机硒形态分析回收率的方法的有益效果：

在样品中加入微量的cu²⁺，消除有机物的干扰，使se(iv)和se(vi)释放出来，被kh2po4溶液提取，试液经过滤后进入高效液相色谱仪分离，单一的含硒成分经形态转换后由原子荧光进行检测，se(iv)和se(vi)回收率在94.77％-116.40％之间，为标准制定提供了科学的依据。。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但发明的实施方式不限于此。

实施例1：一种提高无机硒形态分析回收率的方法，包含以下步骤：

a.称取样品：称取样品0.10g，加入0.1mg·ml^-1的硫酸铜溶液250μl，用0.1mol·l^-1kh2po4溶液定容至3ml；

b.振荡浸提：将定容液放于超级恒温振荡器上在70℃,1500rmp条件下振荡浸提30min；

c.滤膜过滤：将振荡浸提液用0.45μm滤膜过滤；

d.测定：将过滤液用高效液相色谱-氢化物原子荧光联用仪测定无机硒，亚硒酸根离子[se(iv)]和硒酸根离子[se(vi)]回收率在94.77％-116.40％之间，满足分析检测的要求，以此可以制定食品、土壤中无机硒的测定方法标准。

实施例2：一种提高无机硒形态分析回收率的方法，

1、无机硒标样、cu²⁺加入量与se(iv)、se(vi)回收率的关系

称取富硒大米、富硒茶叶、富硒食用菌粉片等样品0.10g，每个4份，分别加入0、300、750、1500μl含量为1μg/ml的se(iv)、se(vi)混合标准溶液和0、50、150、250μl0.1mg·ml^-1的硫酸铜溶液，用0.1mol·l^-1kh2po4溶液定容至3ml，于超级恒温振荡器上在70℃,1500rmp条件下振荡浸提30min，0.45μm滤膜过滤，用高效液相色谱-氢化物原子荧光联用仪测定无机硒，计算回收率，结果见表1.

表1无机硒标样、cu²⁺加入量与se(iv)、se(vi)回收率的关系

从以上结果可以看出：添加cu²⁺可以提高样品的加标回收率，但不同样品需要添加的cu²⁺浓度不一样，0.1mg·ml^-1的硫酸铜溶液加入量在0-250ml之间，样品回收率随硫酸铜溶液浓度增加而升高，当cu²⁺加入量低于150μl时，富硒茶叶、富硒食用菌粉片回收率89.87％-99.87％之间，可以满足分析的要求，但富硒大米的se(iv)回收率仅76.12％，低于80％；当cu²⁺加入量为250μl时，富硒大米回收率为104.40％-116.40％，富硒茶叶回收率为93.00％-106.12％，富硒食用菌粉片为107.60％-114.67％，均能满足分析测定的要求，因此，兼顾各类样品，确定cu2+加入量为250μl。即确定无机硒测定样品前处理方法为：

称取样品0.10g，加入0.1mg·ml^-1的硫酸铜溶液250μl，用0.1mol·l^-1kh2po4溶液定容至3ml，于超级恒温振荡器上在70℃,1500rmp条件下振荡浸提30min，0.45μm滤膜过滤，用高效液相色谱-氢化物原子荧光联用仪测定无机硒。

2、无机硒检测的仪器条件

在该分析方法中，多种形态的硒均能被检测，因此无机硒需要与其它有机硒的形态有效分离。在方法开发中，经过反复多次试验优化，确定了如下仪器参考条件：

(1)液相色谱参考条件

色谱柱：c18色谱柱或相当者。

流动相：2％甲醇-25mmol·l^-1-磷酸氢二铵-0.5mmol·l^-1-四丁基溴化铵溶液，ph＝6.0(4.3)。

柱温：室温。

流速：0.8ml/min-1.0ml/min。

进样量：10-100μl。

(2)氢化物发生条件

氧化剂：0.5％koh+1.0％ki溶液。

还原剂：0.5％koh+2％kbh4溶液。

载流：7％hcl溶液。

紫外灯开/关：开。

(3)原子荧光光谱仪条件

元素灯：硒空芯阴极灯。

负高压：300v。

灯电流(总电流/辅电流)：80/30ma。

载气：400ml/min。

屏蔽气：600ml/min。

在此条件下，se(iv)、se(vi)、硒代胱氨酸、硒代蛋氨酸、l-硒甲基硒代半胱氨酸均能有效分离，定性定量检测。