一种烟草及烟草制品中烟碱的手性分析高效液相色谱法的制作方法

本发明涉及烟草及烟草制品化学成分测定方法，具体涉及一种烟草及烟草制品中烟碱的手性分析高效液相色谱法。

背景技术：

烟碱，也叫尼古丁，是一种存在于茄科植物中的生物碱，也是烟草的重要成分。烟碱分子含有一个手性中心，即四氢吡咯环上的2位碳原子，所以烟碱有两个对映体：S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱。烟碱的两个对映体具有完全不同含量、代谢机理和生理特性。因此需进行烟草及烟草制品中烟碱的手性分析。

目前关于烟碱的手性分析，主要是采用气相色谱法进行研究，例如申请号为201610663534.1的专利《一种卷烟烟丝中烟碱的手性分析方法》，该方法前处理步骤复杂，并且检测时间达到140min，不能满足大量样品的检测，目前尚未有关于烟草及烟草制品中烟碱的手性分析的高效液相色谱方法。因此有必要开发一种灵敏度高、精密度好、适合大批量准确定量烟草及烟草制品中S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱的方法。手性柱-正相液相色谱紫外检测器在异构体分离方面有着明显的优势，因此通过大量实验建立了烟草及烟草制品中烟碱手性的正相液相色谱紫外检测分析方法，该方法更适合用于大量样品中烟碱的手性分析。

技术实现要素：

本发明的目的正是以烟碱为研究对象，对烟草及烟草制品样品进行了前处理方法研究，建立了手性柱-正相液相色谱紫外检测的烟草及烟草制品中烟碱旋光异构体的分析方法，实现了对烟草及烟草制品中烟碱旋光对映体S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱的准确测定。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：将烟草及烟草制品样品干燥、粉碎和过筛，样品经过氢氧化钠溶液浸润后，采用甲基叔丁基醚和甲醇溶液萃取，萃取液经基质分散固相萃取净化后，使用手性柱-正相液相色谱紫外检测器分析，采用峰面积归一化法定量检测烟草及烟草制品中S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱的比例。具体步骤如下：

1. 标准溶液的配制：称取约100.0 mg的S-(-)-烟碱标准品，用正己烷和甲醇溶液（98:2，V/V）稀释定容到50 mL棕色容量瓶中，配制成浓度约为2.0 mg/mL的S-(-)-烟碱标准储备液；称取约50.0 mg的R-(+)-烟碱标准品，用正己烷和甲醇溶液（98:2，V/V）稀释定容到50 mL棕色容量瓶中，配制成浓度约为1.0 mg/mL的R-(+)-烟碱标准储备液；利用S-(-)-烟碱标准储备液和R-(+)-烟碱标准储备液稀释，配制S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱浓度分别为100 μg/mL和5 μg/mL的混合标准溶液，另外分别稀释得到100 μg/mL的S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱标准溶液。

2. 烟草及烟草制品样品的混匀：将烟草及烟草制品样品置于40 ^oC烘箱中，1小时后将烟草及烟草制品取出，粉碎后过0.45毫米孔径标准筛。

3. 烟草及烟草制品样品的萃取：称取0.3 g已粉碎的样品于15mL具塞离心管中，加入2.0 mL 5% 的氢氧化钠溶液，涡旋1min混匀后静置10 min浸润样品。取10 mL甲基叔丁基醚和甲醇（90:10，V/V）溶液到离心管中，并于旋涡混合器上以4000 rpm速度振荡30 min。

4. 萃取液的净化：取1.5 mL萃取上清液于2 mL净化离心管中（内含150 mg无水硫酸镁，25 mg PSA吸附剂，7.5 mg GCB吸附剂，统称基质分散固相萃取材料），于旋涡混合器上以4000 rpm振荡2 min，以10000 rpm离心1min。取上清液过0.45 μm有机相滤膜后进液相分析。

5. 正相高效液相色谱条件：采用对照标样（即混合标准溶液）与样品中烟碱色谱峰的保留时间进行S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱的定性分析，对峰面积进行归一化定量S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱占总烟碱的比例。分析柱为Chiralcel OD-H液相色谱柱(柱长 250 mm ，内径4.6 mm ，固定相粒径5 µm)；流动相为正己烷和甲醇溶液（98:2 ，V/V），流速1 mL/min；等度洗脱；柱温30 ℃；进样体积 10 μL；紫外检测器检测波长252 nm；分析时间15 min。

本发明提供了一种烟草及烟草制品中烟碱的手性分析高效液相色谱法，具有以下优良效果：可减低样品液对色谱柱的污染，液相检测方法灵敏度高，分析时间短，能实现对S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱的基线分离，R-(+)-烟碱的检出限（LOD）为0.08%，能够满足大批量烟草及烟草制品样品中烟碱的手性分析。

附图说明

图1为混合标准溶液的色谱图，

图2为烟草及烟草制品样品的色谱图。

具体实施方式

本发明通过以下具体实施例作进一步描述，但不限制本发明。

1. 仪器和试剂

Agilent 1260高效液相色谱仪配制紫外检测器（美国Agilent公司），AE163电子天平（感量：0.0001 g，瑞士Mettler公司），高速粉碎机（武汉银彩科技有限公司），美国Coleparmer Votex-Genie漩涡振荡器，德国SIGMA 3-30K-高速台式冷冻型离心机。正己烷（色谱纯），氢氧化钠（分析纯），甲醇（色谱纯），，S-(-)-烟碱标准品（CAS：54-11-5），R-(+)-烟碱标准品（CAS：25162-00-9）。

2. 标准溶液的配制

称取约100.0 mg的S-(-)-烟碱标准品，用正己烷和甲醇溶液（98:2，V/V）稀释定容到50 mL棕色容量瓶中，配制成浓度约为2.0 mg/mL的S-(-)-烟碱标准储备液；称取约50.0 mg的R-(+)-烟碱标准品，用正己烷和甲醇溶液（98:2，V/V）稀释定容到50 mL棕色容量瓶中，配制成浓度约为1.0 mg/mL的R-(+)-烟碱标准储备液；利用S-(-)-烟碱标准储备液和R-(+)-烟碱标准储备液稀释，配制S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱浓度分别为100 μg/mL和5 μg/mL的混合标准溶液，另外分别稀释得到100 μg/mL的S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱标准溶液。

3. 烟草及烟草制品样品的混匀：将烟草及烟草制品样品置于40 ^oC烘箱中，1小时后将烟草及烟草制品取出，粉碎后过0.45毫米孔径标准筛。

4. 烟草及烟草制品样品的萃取：称取0.3 g已粉碎的样品于15mL具塞离心管中，加入2.0 mL 5% 的氢氧化钠溶液，涡旋1min混匀后静置10 min浸润样品。取10 mL甲基叔丁基醚和甲醇（90:10，V/V）溶液到离心管中，并于旋涡混合器上以4000 rpm速度振荡30 min。

5. 萃取液的净化：取1.5 mL上清液于2 mL净化离心管中（内含150 mg无水硫酸镁，25 mg PSA吸附剂，7.5 mg GCB吸附剂），于旋涡混合器上以4000 rpm振荡2 min，以10000 rpm离心1min。取上清液过0.45 μm有机相滤膜后进液相分析。

6. 正相高效液相色谱条件：采用对照标样与样品中烟碱色谱峰的保留时间进行S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱的定性分析，对峰面积进行归一化定量S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱占总烟碱的比例。分析柱为Chiralcel OD-H液相色谱柱(柱长 250 mm ，内径4.6 mm ，固定相粒径5 µm)；流动相为正己烷和甲醇溶液（98:2 ，V/V），流速1 mL/min；等度洗脱；柱温30 ℃；进样体积 10 μL；紫外检测器检测波长252 nm；分析时间15 min。

7. R-(+)-烟碱的检出限

烟碱的手性组成通常以R-(+)-烟碱占总烟碱的百分比来表示。为评估R-(+)-烟碱的检出限，本发明方法在S-(-)-烟碱的标准溶液中加入R-(+)-烟碱的标准溶液。结果表明，S-(-)-烟碱的标准溶液中即可观察到R-(+)-烟碱的响应信号，对定量离子峰面积进行归一化后，S-(-)-烟碱的标准溶液中R-(+)-烟碱的比例为0.08%（峰面积相对于总烟碱峰面积），以此作为本方法R-(+)-烟碱的检出限。

8. 烟草及烟草制品样品中烟碱的手性分析实例

将按照上述步骤处理的烟草及烟草制品样品进行正相高效液相色谱分析；采用对照标样与烟草及烟草制品样品烟碱色谱峰的保留时间进行S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱的定性分析，对峰面积进行归一化定量S-(-)-烟碱和R-(+)-烟碱占总烟碱的比例。

采用该方法对10个烟草及烟草制品样品进行了分析，结果见表1。

9. 分析方法的精密度

取同一烟草及烟草制品样品进行5次日内和日间平行测定，考察了本发明方法的精密度，结果见表2和表3。结果表明，烟草及烟草制品样品中R-(+)-烟碱的日内和日间测定结果的变异系数分别为4.48%和7.73%，精密度较好。

采用具体实施方式中的方法对上述10个烟草及烟草制品样品进行了检测。检测得到的色谱图如图1和图2所示。