一种声表面波生物传感器敏感膜的电化学原位制备方法与流程

本发明涉及生物传感器敏感膜的制备方法，特别是一种声表面波生物传感器敏感膜的电化学原位制备方法。

背景技术：

声表面波器件主要有压电基片和叉指换能器组成，电信号传输到叉指换能器时，由逆压电效应将电信号转化成机械波，当机械波传输至另一电极时，由压电效应将机械波转化成电信号。正因为在换能器中传输时是以机械波的形式，所以不受电磁干扰。在叉指换能器表面增加一层敏感膜时，敏感膜对特定的物质产生响应，使敏感膜的重量、粘弹性、电导率、介电常数等物理特性发生改变，对基片表面的声波传输产生扰动，声波的幅度、相位、频率都发生相应的改变。由于引起多种物理特性的变化，使声表面波传感器具有高灵敏度。

通过检测声表面波信号参数的变化，可以实现对待测物的定性和定量分析。目前开发的声表面波生物传感器包括葡萄糖saw(声表面波)传感器、dna测定saw传感器及肿瘤标志物saw传感器等。另外，由于声表面波无源无线传感器具有非接触、快速、无电源、抗干扰，易编码，保密性好，成本低等优点，目前，已广泛应用于许多领域。由它构成的传感器阵列，传感元之间无信号线连接，阵列输出也无需引线连接，分布更容易，应用不受限制，特别适合一些环境复杂，不宜接触的工程结构和环境的遥测、传感和目标识别领域。

本发明中生物敏感膜主要是根据电沉积吸附的原理制成。saw器件连接工作端口，对电极采用惰性金属铂丝，使得溶液中的敏感膜成分在电场作用下沉积至saw器件上，原位制备出的敏感膜修饰的saw传感器。敏感膜成分选择氨基酸和镍，利用saw器件的高灵敏特性，氨基酸敏感膜的生物相容性及成膜性，镍的催化特性，在saw器件的整个区域覆盖敏感膜。

这种电化学机制下原位制备敏感膜的方法，快捷、方便，可以根据需求的不同及时改变生长条件，在成膜过程中可以通过电化学工作站进行观察，使生产人员实时了解成膜情况。对于极其微小的saw器件，生成的膜若发生变化对于高灵敏度的saw器件来说，都有可能是极大的影响，所以，可以直观了解外部环境对成膜造成的影响，避免无谓的损失。

将电化学方法应用于制备saw生物传感器，二者工艺可兼容，生产高效、成本低，而saw传感器的体积小且便于在各种极端环境下应用。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对上述存在问题，提供一种声表面波生物传感器敏感膜的电化学原位制备方法，将电化学方法应用于制备saw生物传感器，二者工艺可兼容，生产高效、成本低；saw传感器的体积小、抗干扰能力强，便于在各种极端环境下应用；检测浓度低，可达到10^-8mol/l。

本发明的技术方案：

一种声表面波生物传感器敏感膜的电化学原位制备方法，在声表面波器件上用电化学方法原位电沉积一层生物敏感膜，具体步骤如下：

1)制备敏感膜装置的清洗

saw传感器敏感膜的制备装置，由参比电极、对电极、工作电极、电极夹、声表面波器件、铂丝、电沉积溶液和密封容器组成，参比电极和对电极分别与铂丝连接，工作电极通过电极夹与声表面波器件连接，电沉积溶液装入密封容器中，铂丝伸入电沉积溶液中，声表面波器件的叉指换能器浸入电沉积溶液中；

将直径为0.5mm的铂丝放在装有无水乙醇的容器中，使需要浸入电沉积溶液的部分铂丝能浸入无水乙醇中，将容器放入超声清洗机中，超声清洗铂丝5-10min，从超声清洗机中取出容器，再从容器中取出铂丝，然后放在装有超纯水的容器中，并将容器放在超声清洗机中，超声清洗铂丝5-10min，最后用滤纸吸去铂丝表面水分；

在容器中放入无水乙醇并使使无水乙醇超过容器的1/3，将容器置于超声清洗机中，超声清洗烧杯5-10min，在烧杯超声的过程中，顺着烧杯口用洗瓶将无水乙醇沿烧杯壁流下，至整个烧杯壁都有无水乙醇流过；

将电极夹放在上述装有无水乙醇的容器中浸泡5min，用洗瓶中的超纯水将电极夹冲洗1-2min，再用滤纸将电极夹擦拭干净，完成制备敏感膜装置的清洗工作；

2)电沉积溶液的配置

配制好的ph值为5-8的缓冲溶液作为底液，在配置好的底液中加入镍盐，底液与镍盐的用量比为10ml：1mmol，溶液放置在超声清洗机中超声3-5min，到溶液完全溶解镍盐颗粒为止；取出装有溶液的容器，在容器中再次加入相应量的强电解质，底液与强电解质的用量比为10ml：1mmol，再次将溶液放置在超声清洗机中超声3-5min，到溶液完全溶解强电解质颗粒为止；取出装有溶液的容器，在容器中再次加入相应量的氨基酸，底液与氨基酸的用量比为1000ml：1mmol，用玻璃棒搅拌溶液1min，倒入容量瓶；把配制好的缓冲溶液沿玻璃棒倒入容器中，冲洗容器和玻璃棒，冲洗过的缓冲溶液倒入容量瓶，反复此冲洗过程3～5次，最后用缓冲溶液定容，并将容量瓶中的溶液前后摇晃均匀，制得所需的电沉积溶液；

3)saw器件的清洗、烘干

用镊子夹住saw器件的端口，使saw器件的叉指部分浸入无水乙醇中涮洗1-3min，取出saw器件，用滤纸吸干叉指表面的无水乙醇，再浸入超纯水中涮洗1-3min，取出saw器件，用滤纸吸干叉指表面的水分，再用红外灯在60-100℃的温度下烘烤1-2min；

4)表面波生物传感器敏感膜的电化学原位制备

容器中倒入步骤2中配制的电沉积溶液，溶液体积为容器的2/3，将铂丝弯折使其与saw器件的叉指部分平行，并用电极夹夹住saw器件的接地端，使saw器件的叉指部分浸入溶液，调节铂丝与saw器件之间的距离保持在1cm，每次电沉积时saw器件和铂丝间的距离保持一定；

夹住saw器件的电极夹连接到设备的工作端口，对电极和参比电极的端口与铂丝相连，构成两电极体系，采用电化学的循环伏安法、多电位阶跃法或者恒电位法把敏感成分沉积到saw器件上；

把沉积上敏感膜的saw器件连电极夹整个取下，将saw器件的叉指部分浸入超纯水中涮洗1-3min，后用滤纸吸干叉指表面的水分，反复此涮洗过程3-5次，用红外灯在60-100℃的温度条件下烘烤1-2min，制得表面波生物传感器敏感膜。

所述步骤2)中配置的缓冲溶液为磷酸缓冲溶液、伯瑞坦-罗比森缓冲溶液或磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，其中：磷酸缓冲溶液中包含了0.1-0.2mol/l的磷酸氢二钠和0.1-0.2mol/l的磷酸二氢钠配制，用0.1-0.2mol/l的磷酸调节ph值；伯瑞坦-罗比森缓冲溶液在三种酸的浓度均为0.04mol/l的磷酸、乙酸和硼酸混合液中，加入0.2mol/l的naoh调节ph值；磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液中为0.2mol/l的磷酸氢二钠并用0.1mol/l的柠檬酸来调节ph值。

所述步骤2)中氨基酸为赖氨酸、丙氨酸、半胱氨酸、色氨酸或络氨酸；镍盐为硫酸镍或硝酸镍；强电解质为氯化钾或硫酸钠。

所述步骤3)中的saw器件为频率不高于435mhz的不同频率的saw单端口谐振器、saw双端口谐振器或延迟线。

所述步骤4)中循环伏安法工艺为：电化学工作站作为电沉积设备，设置电沉积参数，电极之间的初始电压设置在-1～-0.4v，终止电压设置为0.9～1.2v，扫速范围设置为20～100mv/s，循环次数设置为10～30圈；

多电位阶跃工艺为，电化学工作站作为电沉积设备，阶跃1的电位设置为-0.4v，保持0.2s，阶跃2的电位设置为1v，保持0.2s，循环次数设置为1000～5000；

恒电位法工艺为，直流电源作为电沉积的电源，设置直流电源的电压为0.9～1.2v，时间为3～8min。

本发明的特点是：

将电化学方法应用于制备saw生物传感器，二者工艺可兼容，生产高效、成本低；saw传感器的体积小、抗干扰能力强，便于在各种极端环境下应用；检测浓度低，可达到10^-8mol/l。

附图说明

图1为本发明saw传感器敏感膜的装置结构示意图，其中，1为参比电极，2为对电极，3为工作电极，4为电极夹，5为声表面波器件，6为铂丝，7为叉指换能器，8为密封容器。

图2为本发明提供的saw叉指换能器结构的示意图，其中，9为叉指换能器的指条，10为叉指换能器的压电基体，11为敏感膜上的镍颗粒，12为叉指换能器上附有赖氨酸敏感膜。

图3为本发明提供的在saw器件电沉积前后的频率响应，其中，实线为电沉积前声表器件的频率响应，虚线为电沉积后声表器件的频率响应。

图4为本发明提供的在saw器件电沉积前后的相位图，其中，实线为电沉积前声表器件的相位，虚线为电沉积后的相位图。

图5为本发明提供的在saw器件电沉积赖氨酸和镍的复合敏感膜后的mapping扫描图。

图6为本发明提供的在已沉积镍-赖氨酸混合敏感膜后的saw单端口谐振器检测不同浓度多巴胺(da)的频率偏移图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。

本发明提供的制作声表面波生物传感器敏感膜的方法，是在声表面波单端口谐振器的叉指上电沉积一层敏感膜，该混合溶液是以ph值为5的缓冲溶液作为底液，使赖氨酸更易溶于溶液中。在混合溶液中加入氯化钾，使声表面波器件在电沉积过程中更易吸附上赖氨酸，形成聚赖氨酸膜。

声表面波器件具有高灵敏特性，氨基酸敏感膜具有生物相容性，生物检测中易于吸附生物分子，而镍有催化的特性，这三个特性相叠加，超灵敏检测生物分子。从传感器件构筑的方法来讲，采用电化学沉积技术在saw叉指电极及石英晶体表面全覆盖敏感膜，做到了增大有效响应面积。saw器件中心频率达到433.97mhz±0.05mhz，属于高频器件，这又有利于提高灵敏度。从原理上讲，其它类型都是属于改变敏感区域的电导率来实现响应，盖该方法制成的敏感膜属于形成了附加电容。从应用角度来讲，可作为无线传感网络的传感器节点。

一种声表面波生物传感器敏感膜的电化学原位制备方法，在声表面波器件上用电化学方法原位电沉积一层生物敏感膜，具体步骤如下：

1)制备敏感膜装置的清洗

saw传感器敏感膜的制备装置，如图1所示，由参比电极1、对电极2、工作电极3、电极夹4、声表面波器件5、铂丝6、电沉积溶液7和密封容器8组成，参比电极1和对电极2分别与铂丝6连接，工作电极3通过电极夹4与声表面波器件5连接，电沉积溶液7装入密封容器8中，铂丝6伸入电沉积溶液7中，声表面波器件5的叉指换能器浸入电沉积溶液7中；

将直径为0.5mm的铂丝放在装有无水乙醇的烧杯中，使需要浸入电沉积溶液的部分铂丝能浸入无水乙醇中，将烧杯放入超声清洗机中，超声清洗铂丝5min，从超声清洗机中取出烧杯，再从烧杯中取出铂丝，然后放在装有超纯水的烧杯中，并将烧杯放在超声清洗机中，超声清洗铂丝5min，最后用滤纸吸去铂丝表面水分。

在25ml烧杯中放入无水乙醇，放入无水乙醇10ml，将烧杯置于超声清洗机中，超声清洗烧杯5min，在烧杯超声的过程中，顺着烧杯口用洗瓶将无水乙醇沿烧杯壁流下，至整个烧杯壁都有无水乙醇流过。

将用到的电极夹放在装有无水乙醇的烧杯中浸泡5min，用洗瓶中的超纯水将电极夹冲洗1min，再用滤纸将电极夹擦拭干净。完成制备敏感膜装置的清洗工作。

2)电沉积溶液的配置

先配制ph值为5的磷酸缓冲溶液，其中：磷酸缓冲溶液中包含了0.1mol/l的磷酸氢二钠和0.1mol/l的磷酸二氢钠配制，用0.1mol/l的磷酸调节ph值；

在15ml的配置好的缓冲溶液中加入0.6572g的硫酸镍，将装有溶液的烧杯放置在超声清洗机中超声3min，到溶液完全溶解硫酸镍颗粒为止；取出装有溶液的烧杯，在烧杯中再次加入0.3551g的硫酸钠，再次将溶液放置在超声清洗机中超声3min，到溶液完全溶解硫酸钠颗粒为止；取出装有溶液的容器，在容器中再次加入0.0036g的赖氨酸，用玻璃棒搅拌溶液1min，倒入容量瓶；把配制好的缓冲溶液沿玻璃棒倒入25ml容量瓶中，冲洗烧杯和玻璃棒，冲洗过的缓冲溶液倒入容量瓶，反复此冲洗过程3次，最后用缓冲溶液定容为25ml，并将容量瓶中的溶液前后摇晃均匀，制得所需的电沉积溶液。

3)saw器件的清洗、烘干

用镊子夹住saw器件的端口，使saw器件的叉指部分浸入无水乙醇中涮洗1min，取出saw器件，用滤纸吸干叉指表面的无水乙醇，再浸入超纯水中涮洗1min，取出saw器件，用滤纸吸干叉指表面的水分，再用红外灯在60℃的温度下烘烤2min。

4)表面波生物传感器敏感膜的电化学原位制备

25ml烧杯中倒入步骤2中配制的电沉积溶液，溶液体积为20ml，将铂丝弯折使其与saw器件的叉指部分平行，并用电极夹夹住saw器件的接地端，使saw器件的叉指部分浸入溶液，调节铂丝与saw器件之间的距离保持在1cm，每次电沉积时saw器件和铂丝间的距离保持一定。

夹住saw器件的电极夹连接到设备的工作端口，对电极和参比电极的端口与铂丝相连，构成两电极体系。采用电化学的循环伏安法，电化学工作站作为电沉积设备，设置电沉积参数，电极之间的初始电压设置为-0.4v，终止电压设置为0.9v，扫速范围设置为100mv/s，循环次数设置为30圈，之后开始沉积，把敏感成分沉积到saw器件上。

把上述沉积上敏感膜的saw器件连电极夹整个取下，将saw器件的叉指部分浸入超纯水中涮洗1min，后用滤纸吸干叉指表面的水分，反复此涮洗过程3遍，用红外灯在60℃的温度条件下烘烤2min。

制备的saw生物敏感膜如图2所示，其中，9为叉指换能器的指条，10为叉指换能器的压电基体，11为敏感膜上的镍颗粒，12为叉指换能器上附有赖氨酸敏感膜。

图3为本发明提供的在saw单端口谐振器电沉积前后的频率响应，其中，实线为电沉积前声表器件的频率响应，虚线为电沉积后声表器件的频率响应。从图中可以直观的看出电沉积前后saw单端口谐振器的中心频率发生偏移，说明在saw单端口谐振器的叉指换能器上生成敏感膜。

图4为本发明提供的在saw单端口谐振器电沉积前后的相位图，其中，实线为电沉积前声表器件的相位，虚线为电沉积后的相位图。从图中可以直观的看出电沉积前后saw单端口谐振器的中心频率发生偏移，说明在saw单端口谐振器的叉指换能器上生成敏感膜。

图5为本发明提供的在saw器件电沉积赖氨酸和镍的复合敏感膜后的mapping扫描图。从图中看出叉指换能器上生成的敏感膜为赖氨酸和镍的混合敏感膜。

图6为本发明提供的在已沉积镍-赖氨酸混合敏感膜后的saw单端口谐振器检测不同浓度多巴胺(da)的频率偏移图。从图中看出镍-赖氨酸混合敏感膜对多巴胺(da)有吸附作用，并且具有规律性，可依据此规律制作出检测多巴胺(da)的生物传感器。