禽流感病毒NP蛋白抗原表位多肽及其胶体金试纸盒的制作方法

本发明属于动物医学生物
技术领域：
，尤其涉及一种禽流感病毒np蛋白抗原表位多肽及其制备的胶体金试纸盒。
背景技术：
：h9n2亚型禽流感病毒(aiv)是由a型流感病毒引起禽类的一种从呼吸系统到严重全身败血症等多种症状的传染病，属甲型流感病毒。1966年第一株h9n2亚型禽流感病毒被homee从患温和呼吸道病的火鸡中分离到。直到1994年，我国首次报道分离得到h9n2亚型禽流感，随后陆续出现相关报道。但由于h9n2亚型禽流感病毒致病性和死亡率都没有h5n1和h7h1高，感染往往不易察觉，也不受到养殖户的重视。其实h9n2亚型禽流感病毒感染可引起鸡群的产蛋下降，引发呼吸道症状并提高鸡群对其它病原的易感性。禽流感流行至今尚无法加以有效控制的主要原因是其表面蛋白极易发生变异，使人们难以弄清其变化的真正规律。禽流感病毒属于正黏病毒科，是单股负链rna病毒，由8个基因片段组成，可以编码12种病毒蛋白，分别为血凝素(ha)、神经氨酸酶(na)、核蛋白(np)、非结构蛋白(ns1、ns2、pb1-f2和n40)、基质蛋白(m1、m2)、聚合酶复合体(pa、pb1和pb2)。np核蛋白是一种多功能蛋白质，不仅组成病毒的核衣壳，通过形成rnp复合体来稳定vrna使其免受外界干扰外。还在病毒的复制过程中对其基因组rna在细胞核内外的运输及蛋白定位起着关键作用，具有免疫保护性。此外np蛋白作为细胞免疫的靶抗原可诱导机体产生细胞毒性t淋巴细胞反应，在不同的亚型之间产生交叉免疫保护性。在禽流感病毒的所有蛋白质中，np蛋白由禽流感病毒第5节段的rna编码，含1494个核苷酸，编码498个氨基酸，分子质量56kd。与病毒基因组rna及病毒聚合酶的3个亚单位pb1、pb2和pa相连，在与病毒颗粒rna节段的相互作用中充当骨架，形成rnp。另外np蛋白和m蛋白共同决定了病毒的型特异性，能够影响病毒基因组的转录与复制。是能在细胞浆与细胞核间穿梭的转运蛋白，参与病毒生活周期的多个阶段。同时作为细胞多肽包括肌动蛋白、细胞核输入及输出装置所需的主要成分。所以np蛋白在禽流感病毒生活的多个阶段中发挥着重要作用，关于它的研究具有重要意义。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是提供h9亚型禽流感病毒np蛋白细胞抗原表位多肽，从而弥补现有技术的不足。本发明的h9亚型禽流感病毒np蛋白抗原表位多肽，其特征在于，所述抗原表位多肽包含有：1)氨基酸序列为seqidno:1的多肽；2)在1)中的氨基酸序列上取代、缺失、添加一个或几个氨基，由1)所衍生的多肽。进一步的，本发明还提供了编码所述的抗原表位多肽的核苷酸序列。在本发明中，优选的，所述的核苷酸序列如seqidno:2所示。含有所述的核苷酸序列的表达载体以及含有所述表达载体的宿主细胞也应属于本发明所要求保护的范围。本发明另一个方面是提供一种用于检测禽流感病毒np核蛋白胶体金免疫层析试纸条。该试纸条包括：最底层的支持板，支持板上层是样品垫和其上含有金标抗体的偶联垫，含有检测线t和质控线c的nc膜和吸水垫；所述金标抗体为胶体金标记h9亚型禽流感病毒np蛋白单克隆抗体。上述h9亚型禽流感病毒np蛋白单克隆抗体是针对氨基酸序列为seqidno:1的多多肽的特异性单克隆抗体上述试纸条中，所述胶体金微粒直径为18-25nm。上述试纸条中，所述检测线t由h9n2亚型禽流感病毒的多克隆抗体形成；本发明筛选获得的h9亚型禽流感病毒np蛋白抗原表位多肽较h9n2亚型禽流感病毒wd-1株标准多肽序列有两个氨基酸位点的变异，其hi效价更高且单抗的相对亲和力更高。附图说明图1：h9亚型禽流感病毒胶体金试纸条的结构示意图；图2：实施例2检测h9亚型禽流感病毒抗原的结果示意图；图3：本发明灵敏度检测结果。其中1、样品垫；2、灌注有金标抗体的偶联垫；3、硝酸纤维素(nc)膜；4、吸水垫；5、h9亚型禽流感病毒检测区t；6、质控区c；7、支持板。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。h9n2亚型禽流感病毒株wd-1是青岛蔚蓝生物制品有限公司疫苗生产株。ndv毒株lasota是青岛蔚蓝生物制品有限公司疫苗生产新城疫病毒弱毒株。ibv毒株massachussetts41记载在文献：谢志勤,谢芝勋,吕华刚.等.30株鸡传染性支气管炎病毒标准株与分离株s1基因的克隆及序列分析[j].西南农业学报,2008,21(6):1733-1736；由青岛蔚蓝生物股份有限公司生药研发中心获得。其中，h9n2亚型禽流感病毒(wd-1)病毒含量为29haunit/50ul；ndv毒株lasota病毒含量为27haunit/50ulibv毒株massachussetts41病毒含量为105.9eid50/ml本发明用peg沉淀超速离心浓缩纯化的禽流感h9n2亚型病毒免疫balb/c小鼠，用表达好的重组np蛋白、纯化流感病毒和hi实验进行筛选，共制备2株能稳定分泌抗np特异性抗体的杂交瘤细胞株。同时进一步westernblot鉴定和ifa的方法鉴定了能与真核表达系统瞬时表达的np蛋白特异性结合的2株mabs，验证了mabs的特异性，分别命名为np-mab1b2和2b5。利用噬菌体展示肽库技术筛hi效价最高的选抗npmab1b2的克隆，最终获得12个阳性克隆，测序后得到8个多肽序列，下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本其共有序列为lealdsntl，与所用毒株的np蛋白编码氨基酸序列比对发现其与aa371～aa379有7个氨基酸位点完全匹配，提示371ieamdsntl379为np抗原的一个线性表位。发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。实施例1禽流感h9n2亚型病毒线性抗原表位的鉴定1材料和方法主要实验材料和实验动物:sp2/0细胞由申请人所在实验室保存；表达aiv(h9n2)np蛋白的重组质粒pet32a-np由本实验室构建；aiv(h9n2)病毒由本实验室保存；spf鸡胚购自梅里亚；6～8周龄spfbalb/c雌性小鼠购北京医学院实验动物中心。主要试剂:peg6000(merck)、蔗糖(上海国药)、弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂(sigma)、rabbitantimouse-hrp(sigma)、rabbitantimouse-fitc(sigma)、噬菌体展示肽库试剂盒(neb)重组抗原的纯化和鉴定：申请人从已经注射过禽流感病毒疫苗，但还是发生了禽流感病的患病个体中筛选了禽流感病毒，将该禽流感病毒用生理盐水1：10000倍稀释后接种于10日龄鸡胚，每个鸡胚注射0.2ml，(35+1)℃、60％湿度培养三天后将鸡胚置于4℃过夜，收其尿囊液测定其血凝活性。反复冻融三次后离心取上清，缓慢搅拌加入nacl至0.5mol/l，再搅拌加入等体积的10％的peg6000，4℃过夜。8000rpm离心30min取沉淀，加入原体积10％的pbs混悬后4℃过夜。8000rpm离心取上清用20％、40％、60％的蔗糖18000rpm密度梯度离心2h，40％-60％间收集病毒层，加入pbs适量后18000rpm离心2h取沉淀pbs混悬。测定血凝价和蛋白浓度，分装后-20℃保存备用。同时spf鸡胚尿囊液同上操作留存阴性对照品。动物免疫：纯化后的病毒与佐剂等体积混合免疫雌鼠，免疫采用肌肉注射的方式，剂量为50μg/只，每隔2周免疫一次，免疫3次。3免后7d断尾采血，利用np重组蛋白包被的elisa板测血清效价。在融合前3d选择血清效价最高的小鼠腹腔注射100ug加强免疫。np重组蛋白间接elisa方法的建立：按常规间接elisa操作，利用方阵法确定mabs的筛选条件。纯化后的np重组蛋白浓度为0.95mg/ml，用包被液对其进行1:10、1:50、1:100、1:200、1:500倍稀释，用pbs对阳性血清进行1：500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000倍稀释。以阳性孔od值最接近于1，p/n值大于2的蛋白和血清浓度作为最佳工作浓度。aiv病毒蛋白间接elisa方法的建立：按常规间接elisa操作，利用方阵法确定mab的筛选条件。纯化后的np重组蛋白浓度为1.2mg/ml，用包被液对其进行1:10、1:50、1:100、1:200、1:500倍稀释，用pbs对阳性血清进行1：500、1:1000、1:2000、1:4000、1:8000倍稀释。以阳性孔od值最接近1，p/n值大于2.1的蛋白和血清浓度作为最佳工作浓度。杂交瘤细胞的制备：将小鼠脾细胞和sp2/0细胞融合后的融合细胞用np核蛋白间接elisa和aiv病毒蛋白间接elisa平行检测，取双阳性的克隆用有限稀释法进行克隆培养，克隆3～4次后获得稳定分泌特异性mabs的杂交瘤细胞。将取得的阳性细胞株上清用hi实验做筛选，取有hi效价的克隆进行建株。mab腹水的制备：按常规方法，取6-8周龄的雌性blab/c小鼠腹腔注射液体石蜡0.5ml/只，1周后注射1×106个细胞/只，所得腹水5000rpm离心取上清，-20℃分装保存。分别检测hi效价、间接elisa效价和亚类鉴定。westernblot鉴定：按常规sds-page方法：6％浓缩胶，15％分离胶进行电泳后，pvdf膜，15v转印0.5h，将转印后的pvdf膜封闭过夜后，pbst洗涤后将腹水1:200稀释后37℃孵育100min，洗涤后加二抗37℃孵育60min，洗涤后dab避光显色15-30min至条带清晰。蒸馏水洗涤后拍照记录。ifa鉴定：将鸡胚成纤维细胞(cef)经过0.5％胰酶消化，加入24孔细胞培养板，37℃培养箱中培养24h；将病毒按照1:100/1:1000/1:10000稀释后感染cef，36h后出现明显的细胞病变，细胞变圆，出现空斑，进行细胞固定，加预冷的丙酮1ml/孔，室温静置10min，pbs洗涤一遍，加1:100稀释的腹水稀释液200μl/孔，37℃温箱中放置30min，pbs洗涤三遍，加荧光二抗100μl/孔，洗涤后荧光显微镜下观察。mab识别抗原表位的初步鉴定：按照neb公司的噬菌体展示肽说明书对mab对应的抗原表位进行鉴定。将纯化单抗以100μg/ml的浓度包被96孔板100μl，一个克隆包被一排。37℃2h后4℃过夜。甩出包被液，拍干。每孔加200μl封阻液，4℃封闭1h。甩出封阻液，pbst洗板6次，甩干。一抗加100μlpbs，每排第一孔加2×1012个病毒子，开始对噬菌体进行倍比稀释至第12孔。37℃孵育1h。pbst洗板6次，甩干。二抗每孔加入m13-hrp抗体(1：5000)100μl，室温震荡作用1小时。pbst洗板6次，甩干。加入opd显色液100μl/孔，显色10min，终止液终止，酶标仪读值od492。按各个噬菌体od值(s)与阴性对照od值(n)的比值(s/n)>2.1鉴定阳性克隆株。测定扩增前后噬菌体的滴度，以备下轮筛选用。第二、三轮淘选时，mab的包板浓度分别降至75μg/ml、50μg/ml，tbst浓度分别增至0.3％、0.5％，第三轮淘选产物测完滴度后随机挑取噬菌体克隆进行扩增。用100μg/mlmab包板(150μl/孔)，扩增后噬菌体作为一抗进行噬菌体elisa反应。对于反应呈阳性者进行测序。表1、np-mab1b2阳性噬菌体测序结果分析和h9n2np序列比对表k为差异氨基酸序列对比显示其一致序列为lealdsntl，与所用毒株的np蛋白编码氨基酸序列比对发现其在第371个氨基酸处由异亮氨酸变为亮氨酸，第374个氨基酸处由蛋氨酸变为亮氨酸，与aa371～aa379有7个氨基酸位点完全匹配，提示371-ieamddsntl-379为np抗原的一个线性表位。表2、np-mab2b5阳性噬菌体测序结果分析和h9n2np序列比对表噬菌体编插入的外援序列1-leamdsntl-3-gemsdtl-5-i__amdetl-6-ieamdsntr-9-iaf__sntl-11-_etkrsn_l-12-aerlds_t_-13-ieamdsntr-16-kfamisl-一致序列-ieamdsntl-h9n2nieamdsntlek为差异氨基酸序列对比显示其一致序列为ieamdsntl，与所用毒株的np蛋白编码氨基酸序列比对发现其与aa371～aa379的氨基酸位点完全匹配，提示371-ieamddsntl-379为np抗原的一个线性表位。实施例2单克隆抗体抗原表位的优选1、将np-mab1b2和2b5两株细胞产生的单抗分别进行纯化，纯化后的单抗进行hi检测，检测结果1b2较2b5的hi效价更高。表3、np-mab抗体效价检测2、单克隆抗体的相对亲和力常数测定采用硫氰酸盐洗脱法测定单克隆抗体的相对亲和力常数，具体操作步骤如下：(1)取纯化h9亚型禽流感病毒作抗原包被并封闭的间接elisa板，将待测单克隆抗体稀释至饱和浓度，每孔加100μl，37℃孵育1h；(2)pbst洗涤3次后，不同浓度的硫氰酸盐洗脱，依次加入浓度为0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5和5.0mol/l的nascn溶液60μl/孔，室温静置15min。(3)pbst洗涤3次后，加入兔抗鼠hrp-igg(以pbst作1:5000稀释)，每孔加100μl，37℃孵育1h。tmb避光显色后测定od450nm值。(4)结果判定：经硫氰酸盐洗脱后每种抗体与抗原结合的od450nm读值下降至未经洗脱的od450nm值的50％时所对应的nascn浓度，即为该抗体的相对亲和力常数，用mol/l表示。结果如表4所示。表4、单克隆抗体的相对亲和力常数测定结果分别用不同浓度的nascn溶液对2株np-mabs和sp2/0腹水进行洗脱，经测定，1b2的相对亲和力常数为4.5mol/l，具有较高强度的亲和力；2b5的相对亲和力常数依次为2mol/l，具有中等强度的亲和力。即np-mab1b2较np-mab2b5(wd-1株原始序列)有较高亲和力。实施例3h9亚型禽流感病毒胶体金试纸条1、制备抗h9亚型禽流感病毒外膜血凝素抗原的单克隆抗体和兔抗鼠igg抗体制备抗h9亚型禽流感病毒核蛋白抗原的单克隆抗体：(杂交瘤细胞由本实验室制备保存)将筛选出的杂交瘤细胞复苏后扩大培养，制备腹水即h9亚型禽流感病毒抗体。elisa鉴定h9亚型禽流感病毒核蛋白抗原的单克隆抗体的活性和效价，纯化备用；制备兔抗鼠igg抗体：利用常规方法以纯化后小鼠igg为免疫抗原，对兔进行免疫，两周后采集静脉血，用elisa方法测定抗鼠igg抗体的活性和效价，纯化备用。h9亚型禽流感病毒多克隆抗体为h9亚型禽流感鸡阳性血清：青岛蔚蓝生物生物制品有限公司提供，经血凝抑制试验方法鉴定呈阳性，浓度为0.2mg/ml。2、胶体金溶液的制备准确移取1ml1％haucl4溶液于150ml锥形瓶中，加水至总体积约为95ml，得到四氯金酸水溶液；水浴加热至97℃，在搅拌条件下加入5.0ml10g/l柠檬酸钠水溶液，混匀得到混合液(haucl4和柠檬酸钠的质量配比1:5)；再将混合液置于97℃水浴中加热10min(搅拌)，再在室温(25℃)下搅拌10min，自然冷却后，得到胶体金溶液，用水定容到100ml容量瓶中。胶体金的粒径为15-28nm。3、金标抗体的制备用0.1mol/lk2co3溶液调节胶体金溶液至ph值为9.0；向10mlph值为9.0胶体金溶液中的加入50μl浓度为1mg/mlh9禽流感病毒核蛋白单克隆抗体，常温25℃搅拌30min，5200g离心20min，弃上清收集沉淀；再向沉淀中加入含有质量百分含量为1％的bsa的20mmol/l硼酸钠水溶液，25℃搅拌30min进行封闭，9000g离心20min，弃上清收集沉淀；将沉淀分散在1ml含有1％bsa和0.1％叠氮钠的20mmol/l的硼酸钠水溶液中，使金标抗体恢复至原体积的1/10，放置在4℃冰箱保存备用，得到金标抗体。h9亚型禽流感病毒np-mab1b2抗体由青岛蔚蓝生物制品有限公司制备。4、胶体金免疫层析试纸条的组装一种h9亚型禽流感病毒胶体金试纸条，所述试纸条由nc膜(nc-a101millipore135，孔径为8μm，2.5cm×30cm，有背衬，millipore)、样品垫(bt50，厚度0.52mm，吸水量53mg/cm2，上海金标生物科技有限公司)、偶联垫(sb08，厚度0.33mm，吸水量63.1mg/cm2，上海金标生物科技有限公司)、吸水垫(ch27，厚度0.69mm，吸水速度65.8s/4cm，吸水量62.5mg/cm2，上海金标生物科技有限公司))和支持板(pvc胶板)等构成。将nc膜置于biodotxyz喷点系统(xyz3200)平台上展平压紧，200μl0.25mg/mlh9亚型禽流感病毒多克隆抗体放于a池，200μl1mg/ml兔抗鼠lgg放于b池，开机后将h9亚型禽流感病毒多克隆抗体和兔抗鼠lgg分别点射于nc膜上，形成检测线(t)和质控线(c)。室温25℃自然晾干后，将其浸泡入封闭液(1％bsa的pbs缓冲液，ph＝7.4)中30min，37℃烘干后，加入干燥剂，4℃密封保存，得到含有检测线(t)和质控线(c)nc膜。所述胶体金溶液的ph值为9.0；将玻璃纤维棉裁成10mm的细条，放入含5％bsa，2％蔗糖，0.8％nacl和0.05％nan3的pbs处理液中20min，37℃恒温烘干，然后将由上述3制备的金标抗体灌注在已处理好的玻璃纤维棉上，真空冻干4h，即为偶联垫。样品垫要用含2％bsa，1％蔗糖，0.5％硼酸钠和0.1％nan3的pbs处理后，37℃干燥备用。在支持板上，将nc膜、样品垫、偶联垫、吸水垫等按如下工艺组装在一起(如图1所示)：nc膜的底面粘贴在支持板上面，在该nc膜的两端上分别粘贴偶联垫和吸水垫在该玻璃纤维膜的另一端粘贴样品垫，叠压宽度为2mm。用切割机制成3.5mm宽的试纸条，刚入带干燥剂的密闭容器中储存，得到胶体金免疫层析试纸条。下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的。实施例4检测h9亚型禽流感病毒抗原本实施例利用实施例3制得的试纸条对易感家禽的咽喉分泌物和泄殖腔分泌物等样品中的h9亚型禽流感病毒抗原进行检测。具体步骤如下：(1)采集样本：使用无菌pp(聚丙烯)杆的聚酯海绵拭子采集样本。咽喉分泌物采集：将拭子从口腔完全插入喉部气管中，适度转动几下，取出拭子。泄殖腔分泌物采集：收集泄殖腔分泌物时，将拭子插入泄殖腔中，轻轻转动并向泄殖腔内部推动拭子，贴泄殖腔壁旋转拭子三次，取出拭子。(2)样本采集后应尽快用已加入500μl稀释液(0.85％生理盐水，ph值7.0±0.2)的1.5ml样本提取管进行处理(2小时内)，即将棉拭子插入稀释液中用力搅拌、挤压，尽可能使棉拭子上的样品洗脱，管内液体即为待处理样品。(3)取由实例3制备的胶体金免疫层析试纸条进行检测，并做好标记。将200μl待处理样品滴加到试纸条的样品孔(y)中，待液体爬至观察窗口，15分钟内观察显示的结果，30分钟后显示的结果无效。(4)检测结果(参见图2)，若nc膜的检测区出现一条肉眼可见的深色线(检测线t)，即表明样品中含有大量h9亚型禽流感病毒抗原，即说明受检家禽的机体已经被h9亚型禽流感病毒感染(参考图2中的阳性)；若nc膜的检测区未出现一条肉眼可见的深色线，即表明样品中未含有大量的h9亚型禽流感病毒抗原，说明受检家禽未被病毒感染(参考图2中的阴性)；当样品通过nc膜的检测线t移动至质控线c时，无论样品中有没有h9亚型禽流感病毒抗原，质控线c都会有一条深色线(c线)；若指控线c无色线出现，说明试纸条已经过期或操作有误。(5)测试结束后，将使用后的试纸条、样本提取管和口腔取样器按生物医疗废弃物进行处理。实施例5胶体金免疫层析试纸条的特异性和灵敏度检测1、特异性检测以下灭活的禽流感病毒为37℃下用0.1％甲醛振荡灭活对应亚型禽流感病毒毒株4小时得到。以灭活h9n2亚型禽流感病毒(阳性对照，h9)、新城疫病毒(ndv)gx1/00和传染性支气管炎病毒(ibv)massachussetts41为待测样品，用由实施例3制备的胶体金免疫层析试纸条进行检测，检测方法如下：将试纸条平放，取200μl待处理样品，滴加到试纸条的样品孔(y)中，任其沿着试纸条自由扩散，15min内观察结果。结果：灭活h9n2亚型禽流感病毒在t线和c线位置同时出现两条深色反应带，结果判定为阳性；其它禽类病毒(ndv、ibv)均呈阴性反应，说明本发明的试纸条具有高度的特异性。2、灵敏度检测spf鸡泄殖腔棉试纸样品(健康鸡)作为阴性对照，以pbs缓冲溶液将h9n2亚型禽流感病毒(wd/hbtx/yth9n2)分别稀释10倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍，用由实施例3制备的胶体金免疫层析试纸条按照如下步骤的方法进行检测。结果如图3所示，10倍、50倍、100倍、200倍、300倍、400倍在t线和c线位置同时出现两条深色反应带，结果判定为阳性，500倍、600倍、700倍的样品只在c线位置出现一条深色反应带，结果判定为阴性。结果说明该试纸条的灵敏度为1∶400。若检测线t处和质控线c处均出现两条深色反应带，结果判定为阳性，待测样品含有或候选含有h9亚型禽流感病毒；若仅有质控线c处出现一条深色反应带，结果判定为阴性；待测样品不含有或候选不含有h9亚型禽流感病毒；其他情况，均为无效试纸条。随机取出不同批次和批间的试纸条，进行h9亚型病毒重复性试验，检测结果显示保存3个月之内试纸条效果良好，无特异性产生。因此，用上述试纸条能够检测或辅助检测待测样品是否含有h9亚型禽流感病毒。sequencelisting<110>青岛蔚蓝生物制品有限公司<120>禽流感病毒np蛋白抗原表位多肽及其胶体金试纸盒<130><160>2<170>patentinversion3.5<210>1<211>9<212>prt<213>1<400>1leuglualaleuaspserasnthrleu17<210>2<211>27<212>dna<213>2<400>2ctggaggctctcgactccaataccctg27当前第1页12