测定芦丁与蛋白结合水平的表面等离子体共振分析方法与流程

本发明涉及分析化学中表面等离子体共振技术的应用方法，具体涉及一种用于测定芦丁与蛋白质相互作用结合水平的表面等离子体共振分析方法。

背景技术：

表面等离子体共振(surfaceplasmonresonance,spr)技术是一种在分子间相互作用的分析领域中广泛使用的方法。其基本原理为利用入射光照射spr传感芯片，使得入射光产生的倏逝波与传感芯片表面金属的表面等离子波发生共振，影响出射光的性质；此后在传感芯片表面发生相互作用反应，引起共振条件的变化，导致出射光性质发生变化，对其进行监测即可实现对相互作用反应的检测。在一般的spr分析过程中，相互作用反应的一个参与物往往通过共价键、静电作用、疏水作用等等方式被固定于spr检测芯片表面，然后将另一个(或几个)反应的参与物溶解后流动通过该检测芯片表面。当发生相互作用反应时，反应物的结合或解离将导致检测芯片的表面性质发生改变，反映为仪器信号的改变。spr技术可以进行快速、灵敏、无标记的分析，经常被用于测定相互作用反应的速率常数、平衡常数等物理化学数据。

芦丁(rutin)是一种黄酮类化合物，在自然界，特别是植物中广泛分布，在一些植物的根、茎、叶、果实等器官和组织内都可以被发现。芦丁的结构式如下：

芦丁具有明显的生理活性，是常见的食品和中药，例如荞麦、银杏、槐米、枸杞、芸香、益母草、芦荟、柴胡、桉叶，以及烟草中的重要活性成分。芦丁的结构式如图1所示。芦丁具有较强的抗氧化活性，在人体中可以维持血管壁的张力、提高其弹性，降低血管壁脆性和渗透性，因而可以改善微血管循环、降低血脂和胆固醇含量，可以在心脑血管疾病的治疗中发挥作用。此外，芦丁还具有一定的抑菌和抗衰老作用，并且可以影响胰岛素的分泌并提高胰岛素受体亲和力，在糖尿病治疗领域中也有一定的应用。芦丁进入人体后，需要通过与多种蛋白质发生相互作用以实现其生理、药理功能，例如其浓度较高时需要与血液中的人血清白蛋白(humanserumalbumin，hsa)发生结合从而随着血液循环而被输运到其他器官或组织，然后再解离以发挥生理功能，其功效发挥也和其与生物酶或者特异和非特异受体的结合有关。因此，研究芦丁与蛋白质相互作用的有关过程，特别是求得其与多种蛋白质发生结合反应的平衡常数，对其药理、药代动力学等研究具有重要意义。

作为一种快速、无标记、实时的分析手段，spr法本质上适合于芦丁-蛋白质相互作用的分析，但在实现过程中却存在着困难，即芦丁的溶解性问题。spr是一种质量敏感型的分析方法，其信号强度取决于传感芯片表面附近(50纳米内)被测物质量的大小，因此当被分析物是芦丁等小分子物质时，它必须在水环境中有足够大的溶解度，以形成足够强的信号。特别地，为了模拟生理环境，spr分析过程往往使用含有无机盐的缓冲溶液来制备样品溶液，这进一步导致了芦丁溶解度降低的问题。已有专利方法中并无使用spr法研究芦丁与蛋白质相互作用的方法。因此，有必要通过分析步骤的改进，改善芦丁在水溶液中的溶解性，并以此为基础开发基于spr的芦丁-蛋白质相互作用结合水平的快速分析测定方法。

技术实现要素：

为了弥补现有方法的不足，特别是芦丁溶解度问题导致的分析困难，本发明的目的是提供一种基于表面等离子体共振原理的新型相互作用分析方法，实现对芦丁和蛋白质相互作用结合水平(即结合反应的平衡常数)的测定。

本发明的分析方法包括传感芯片的清洁、芯片表面的羧基化修饰、蛋白质溶液ph的筛选、芯片表面羧基的活化、蛋白质的共价结合、芦丁的溶解与稀释、蛋白质与芦丁相互作用过程的测定、数据分析等步骤。具体过程如下，各步骤须依次进行。

1、传感芯片的清洁。

当spr传感芯片(通常为镀金玻璃片)为可拆卸式结构时，将传感芯片整体浸没于由浓氨水、30％过氧化氢、水按体积比1:1:5混合而成的溶液中，并置于60-95℃环境中至少10分钟，然后以水清洗，干燥后使用。当传感芯片为不可拆卸式结构(即金属层直接镀于棱镜表面)时，在芯片表面检测窗口位置滴加上述溶液，并置于低于90℃但尽可能高(不损坏棱镜等结构)的温度下至少30分钟，然后以水洗净表面并干燥后使用。也可以使用全新传感芯片。

优选的，每次分析流程均使用全新传感芯片，为镀有裸露金膜的玻璃片，一次性使用，分析完成后弃去。

2、芯片表面的羧基化修饰。

将清洁的传感芯片安装入spr仪器后，使满足以下条件的溶液流通经过芯片表面：溶质为一种巯基取代的直链羧酸，其中巯基位于碳链远离羧基的另一个末端；碳链长度为含有三至二十碳原子，即巯基丙酸、巯基丁酸直至巯基二十烷酸之一；溶质浓度为2mmol/l至50mmol/l；溶剂为水和/或乙醇，视何者能将溶质溶解至所需浓度而定。流通过程中实时监测spr信号，流通时间从进样后直到spr信号不再变化为止，但至少为1分钟，溶液流速为0.1微升/分钟至1毫升/分钟，视流通池体积而定。以上步骤完成后以水冲洗整个管路和芯片表面。流通时芯片区域温度为0℃至60℃。

优选的，使用5mmol/l的3-巯基丙酸水溶液以5微升/分钟的流速流通30分钟，芯片区域控温37℃，完成后以水冲洗管路和芯片表面。

3、蛋白质溶液的ph筛选。

本方法所针对的目标蛋白为水溶性蛋白质，其等电点大于4。实时监测spr信号，使用满足以下条件的溶液流通经过芯片表面：蛋白质浓度为1纳克/毫升至50毫克/毫升中的某一个值；溶剂为乙酸-乙酸钠缓冲溶液，钠离子浓度为不超过50mmol/l的一个值；ph为2.5至6.0中的至少3个值，范围须覆盖至少2个ph单位，间隔至少为0.2，至多为1个ph单位。即，流通的溶液为几种固定蛋白种类和浓度、固定缓冲液浓度但ph不同的溶液。每个溶液流通相同的时间，介于5秒和60分钟之间，流速相同，介于0.1微升/分钟至1毫升/分钟之间。芯片区域温度为0℃至60℃间的一个值。比较各个不同ph的蛋白溶液流经羧基修饰的芯片时spr信号的变化。若在所尝试的几个ph值中、所使用的流通时间下，各溶液均使spr信号达到稳定，则选择稳定后信号与基线相差最大的溶液的ph用作后续分析；若在使用的流通时间下各溶液均未使信号达到稳定，则选择信号变化最快的溶液的ph用作后续分析；若部分达到稳定部分未达稳定，则选择流通完成时刻信号与基线相差最大的溶液的ph用作后续分析。此步骤完成后用水冲洗整个管路和芯片。

优选的，将蛋白质分别溶解于钠离子浓度为10mmol/l，ph分别为4.0，4.5，5.0，5.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，以5微升/分钟的流速各流通5分钟，控温37℃，选择结束时信号变化最大的溶液的ph。

4、芯片表面羧基的活化。

选择下述两种方法之一将芯片表面修饰的巯基羧酸的羧基进行活化。

其一，使满足以下条件的溶液流通经过芯片表面：溶质为edc，即n-(3-二甲氨基丙基)-n’-乙基碳二亚胺盐酸盐和nhs，即n-羟基丁二酰亚胺，两者浓度均为0.0001至0.5克/毫升，且edc浓度不低于nhs浓度，流速介于0.1微升/分钟至1毫升/分钟之间，流通时间以spr信号不再变化为准，但至少为1分钟。芯片区域温度为0℃至60℃间的一个值。

其二，先后使edc溶液和nhs溶液分别流通经过芯片表面，各自浓度范围、流速均同上，流通时间均以各自的spr信号不再变化为准，但各自均至少为1分钟。芯片区域温度为0℃至60℃间的一个值。

优选的，以edc和nhs的混合溶液流通30分钟，两者浓度分别为0.01和0.002克/毫升，流速为5微升/分钟。控温为37℃。

5、蛋白质的共价结合。

将目标蛋白质用第3步中确定的缓冲液溶解，蛋白质浓度为1纳克/毫升至50毫克/毫升之间，然后使之流通经过芯片表面，芯片区域温度为0℃至60℃间的一个值。流速介于0.1微升/分钟至1毫升/分钟之间，流通时间以spr信号不再变化为准，但至少为1分钟。完成后以水冲洗管路和芯片。

优选的，使用0.01克/毫升、ph为5.0的蛋白溶液，以5微升/分钟流速流通20分钟，控温37℃。

6、芦丁的溶解与稀释。

选择磷酸盐缓冲溶液(pbs)、tris缓冲溶液(三羟甲基氨基甲烷缓冲液，tbs)或者hepes缓冲溶液(n-2-羟乙基哌嗪-n’-2’-乙基磺酸缓冲液，hbs)溶液之一，25℃时ph为6.6至8.5，向其中添加3％至15％吡啶(体积分数)。此后添加适量其他添加剂，例如乙二胺四乙酸钠(edta)和表面活性剂p20等，总质量分数不超过5％。以此溶剂作为芦丁的稀释溶剂。

将芦丁溶解于纯吡啶，浓度为1-50mmol/l中的一个值。以上述稀释溶剂稀释此芦丁的吡啶溶液，至少得到3个不同浓度，且每个浓度间至少相差20％。每次稀释水含有芦丁的吡啶时，以相同比例稀释一个未溶解芦丁的纯吡啶，得到不同浓度的吡啶溶液，其吡啶含量和上述稀释的含有芦丁的溶液相同。各溶液中芦丁浓度分别记为c1、c2、…ci。

优选的，以hbs-ep+缓冲液(含有10mmol/lhepes，0.15mol/l氯化钠，3mmol/ledta，0.005％体积分数的表面活性剂p20，,25℃时ph为7.4)中添加8％(体积分数)吡啶的溶液为稀释剂，将芦丁溶解于纯吡啶至10mmol/l，然后以此稀释剂稀释至0.06、0.10、0.20、0.25、0.30mmol/l，每次稀释时均以相同比例稀释一个不含芦丁的纯吡啶溶液。

7、蛋白质与芦丁相互作用过程的测定。

将spr仪器管路中的流通溶液替换为第6步中所用的芦丁稀释溶剂。将第6步中得到的各个浓度的芦丁的稀释后溶液与对应的各不含芦丁的稀释的吡啶溶液按照由稀至浓、先吡啶后芦丁的顺序依次送入spr仪器进行分析。样品流速介于0.1微升/分钟至1毫升/分钟之间，芯片区域控温0℃至60℃之间。每次进样后均记录信号直至不再变化，且至少维持1分钟。每次进样直至信号接近稳定后，停止进样，以质量分数1％至10％之间的十二烷基硫酸钠(sds)溶液冲洗管路和芯片直至信号接近稳定，此后再将管路中溶液替换为第6步中所用的稀释溶剂，进行下一次分析。记录每一个浓度为ci的芦丁溶液进样且信号稳定后的信号值，记为ri，每一个与ci同样稀释，但是不含芦丁的溶液进样且信号稳定后的信号值为ri。

优选的，控温37℃，每次分析时样品流速为5微升/分钟，使用的sds质量分数为5％。

8、数据分析。

按照以下步骤求得所用蛋白质与芦丁发生结合反应的平衡常数。

a、如步骤7中所述，记录各ci时的ri和ri；

b、计算各个1/ci和1/(ri-ri)，并以1/(ri-ri)对1/ci作图，1/ci为横坐标，1/(ri-ri)为纵坐标。

c、对图中数据点进行线性拟合，所得方程的截距记为b，斜率记为a，则结合反应的平衡常数为b/a，单位为实验中所用浓度单位的倒数。

本发明的分析方法中，芦丁用吡啶溶解并以含有吡啶的缓冲溶液稀释，以解决芦丁在水溶液中溶解度不足的问题，使之产生足够强的spr信号。此外，分析过程中在配制稀释的芦丁溶液时一一对应地配制了相同组分但不含芦丁的吡啶的稀释溶液，用于测定吡啶对spr信号的影响，以准确获得芦丁产生的相互作用信号。

附图说明

图1：本发明利用表面等离子体共振技术测定芦丁与蛋白结合水平的分析过程示意图。

图2：本发明的实施例中第7步，hsa蛋白质与含有芦丁的各稀释后溶液相互作用的spr检测结果图，用于求得各ri。

图3：本发明的实施例中第7步，hsa蛋白质与不含有芦丁的各吡啶稀释溶液相互作用的spr检测结果图，用于求得各ri。

图4：本发明的实施例中第8步，所作图和线性拟合结果。

具体实施方式

以下结合附图，通过实施例，进一步阐述本发明的技术方案，但是本申请的保护范围不受这些实施例的具体条件的限制。

实施例：采用本发明中的分析方法测定芦丁与人血清白蛋白(hsa)相互作用反应的平衡常数。具体步骤如下。

1、使用全新传感芯片，为镀有裸露金膜的玻璃片。将其安装进入spr仪器，启动仪器，芯片区域控温维持37℃。

2、使用5mmol/l的3-巯基丙酸水溶液以5微升/分钟的流速流通30分钟，芯片区域控温37℃，完成后以水冲洗管路和芯片表面。

3、将hsa溶解于钠离子浓度为10mmol/l，ph分别为4.0，4.5，5.0，5.5的乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，以5微升/分钟的流速各流通5分钟。流通结束时信号变化最大的溶液的ph为5.5，故此后蛋白质共价结合时亦使用此ph的缓冲溶液。

4、以edc和nhs的混合溶液流通30分钟，两者浓度分别为0.01和0.002克/毫升，流速为5微升/分钟。

5、使用0.01克/毫升、ph为5.0的hsa溶液，以5微升/分钟流速流通20分钟。

6、以hbs-ep+缓冲液(含有10mmol/lhepes，0.15mol/l氯化钠，3mmol/ledta，0.005％体积分数的表面活性剂p20,25℃时ph为7.4)中添加8％(体积分数)吡啶的溶液为稀释剂，将芦丁溶解于纯吡啶至10mmol/l，然后以此稀释剂稀释至0.06、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30mmol/l，每次稀释时均以相同比例稀释一个不含芦丁的纯吡啶溶液。

7、蛋白质与芦丁相互作用过程的测定。

将spr仪器管路中的流通溶液替换为第6步中所用的芦丁稀释剂。将第6步中得到的各个浓度的芦丁的稀释后溶液与对应的各不含芦丁的稀释的吡啶溶液按照由稀至浓、先吡啶后芦丁的顺序依次送入spr仪器进行分析。样品流速为5微升/分钟，进样后维持5分钟，此后以质量分数5％的sds溶液冲洗管路，再将管路中溶液替换为第6步中所用的稀释溶剂，进行下一次分析。hsa与含有芦丁的各个样品溶液相互作用所得spr信号如图2所示，hsa与各个不含芦丁的吡啶稀释溶液的相互作用所得spr信号如图3所示。本实施例中，c1＝0.06mmol/l，c2＝0.10mmol/l，c3＝0.20mmol/l，c4＝0.25mmol/l，c5＝0.30mmol/l；r1＝129ru，r2＝178ru，r3＝225ru，r4＝225ru，r5＝224ru；r1＝118ru，r2＝161ru，r3＝199ru，r4＝198ru，r5＝193ru。

8、数据分析。

按照以下步骤求得所用蛋白质与芦丁发生结合反应的平衡常数。

a、记录各ci时的ri和ri；已于第7步中叙述；

b、以各个1/(ri-ri)对1/ci作图，1/ci为横坐标，1/(ri-ri)为纵坐标，如图4所示；

c、对图4中各个数据点进行线性拟合，所得方程为y＝3.84×10^-3x+2.02×10^-2，线性系数为0.99。以截距除以斜率，得到芦丁与hsa相互作用的结合常数为5.3mmol^-1·l，即5.3×10³mol^-1·l。