一种稳定的HRP酶促化学发光底物液的制作方法

本发明涉及免疫分析领域，具体而言，涉及一种以hrp为酶促反应的检测体系的化学发光底物液。

背景技术：

化学分析免疫法(chemiluminescenceimmunoassay，clia)是将发光分析和免疫反应相结合，而建立起来的一种新的检测微量抗原或抗体的新型标记免疫分析技术，它既具有免疫反应的特异性，又具有化学发光反应的高灵敏性。它克服了放射性免疫(ria)因使用放射性同位素而引起的放射性危害及污染问题；克服了荧光免疫分析(fia)中所需仪器复杂，背景干扰大的缺点。以其高的灵敏度、低的仪器价格、使用简便、安全、无放射性污染等独特的优势，倍受人们的青睐，成为标记免疫的一个重要方向。其中以吖啶酯(ae)，碱性磷酸酶(alp)和辣根过氧化物酶(hrp)为标记物的化学发光免疫分析为主要发展趋势。

鲁米诺(luminol)、异鲁米诺(isoluminol)及其衍生物是最早在化学发光法中使用的化学发光物质。鲁米诺化学名3-氨基邻苯二甲酰胼，最早由albrecht报道其发光特性。这类物质通过氧化产生α-羟基过氧化物的中间体，该中间体的分解可释放出光能，所发光的性质与反应系统的ph值有关。鲁米诺类化合物的氧化步骤与溶剂组分有关，在质子溶剂中，需要酶来催化各种氧的衍生物氧化鲁米诺；在非质子溶剂中，化学发光只需要氧气和一种强碱；而强的碱性对酶的活性会产生一定的抑制作用，因此利用鲁米诺-过氧化氢-辣根过氧化物酶直接测定生物大分子灵敏度低。

现在市场上普遍用的发光底物稳定性差、本底偏高；发光剂溶液和氧化剂溶液混合后极其不稳定；发光液无色，不利于加样，影响板式化学发光手工操作从而影响实验的重复性，使用成本偏高，这些严重限制了化学发光免疫检测的应用，针对这些问题，我们对其配方进行了研究。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种稳定的hrp酶促化学发光底物液，以解决现有化学发光底物稳定性差、本底偏高、结果不准确、成本高等问题。

本发明采用以下技术方案：

一种稳定的hrp酶促化学发光底物液，包括发光剂溶液和氧化剂溶液，其中，所述发光剂溶液为含有终浓度为0.5～10mmol/l的鲁米诺或鲁米诺衍生物或鲁米诺钠盐，0.5～10mmol/l的对碘苯酚，0.01～5mmol/l的酚酞，以及ph为8.5～10.5的缓冲液；

所述氧化剂溶液为含有终浓度为0.5～10mmol/l的过氧化脲，质量浓度为0.01～0.1％的乙二胺四乙酸二钠，体积比为0.05～0.5％的吐温-20，其ph为4.5～6.5的柠檬酸缓冲液；

在使用时，将所述发光剂溶液和所述氧化剂溶液混合后使用。

如上所述的hrp酶促化学发光底物液，优选地，所述发光剂溶液的缓冲液为0.1mol/l～0.3mol/l硼酸-硼砂缓冲液，所述氧化剂溶液中的柠檬酸缓冲液终浓度为0.1mol/l～0.3mol/l。

如上所述的hrp酶促化学发光底物液，优选地，所述发光剂溶液为含有终浓度为1mmol/l的鲁米诺，1～2mmol/l的对碘苯酚，0.1～0.2mmol/l的酚酞，以及0.2mol/l硼酸-硼砂缓冲液，其ph为9.0～10.0。

如上所述的hrp酶促化学发光底物液，优选地，所述氧化剂溶液为含有终浓度为1mmol/l的过氧化脲，质量浓度为0.04％的乙二胺四乙酸二钠，体积比为0.1～0.25％的吐温-20，0.2mol/l的柠檬酸缓冲液，其ph为5.0～6.0。

如上所述的hrp酶促化学发光底物液，优选地，所述氧化剂溶液还含有质量浓度为0.01～0.1％的proclin300。

如上所述的hrp酶促化学发光底物液，优选地，所述proclin300的质量浓度为0.05％。

如上所述的hrp酶促化学发光底物液，优选地，使用前，将所述发光剂溶液和所述氧化剂溶液按体积比1:1混合后使用。

本发明提供的hrp酶促化学发光底物液，配置简单，采用对碘苯酚作为增强剂，酚酞作为协同增强剂，吐温-20作为稳定剂，进一步提高发光液的稳定性，获得一种稳定的、高信噪比、高灵敏度的、平台期长的、紫红色的hrp酶促化学发光底物液。该hrp酶促化学发光底物液混合后1天空白值未升高，信号值稳定，并经过性能测试后，其有较高的反应稳定性，反应很快能达到最大发光强度，且之后有一个很长时间的平台期，与市场上的发光底物液进行对比，发光强度值高、且灵敏度高。本发明应用于hrp酶促反应具有反应时间短、检测平台期长的特点，在4-8℃可稳定保存2年，可广泛应用于各种以hrp为检测目标的试剂盒中。

本发明的化学发光底物液成本低，稳定性好，并且发光液混合后的颜色为紫红色，相对于白色的化学发光板易用肉眼分辨发光液加量，特别适用于半自动化学发光的手工操作，减少手工操作带来的操作错误，另外由于ph变化可使酚酞溶液变色，本发光液可根据颜色辨认试剂是否长菌、变质，有效避免使用失效试剂而导致不要用的成本增加，及样本的错检率。

附图说明

图1为本发明一优选实施例中发光时间-各时间段两种发光液发光值相对于初始发光值的百分比的对比图。

图2为本发明一优选实施例中发光时间-各时间段两种发光液信噪比的对比图。

图3为本发明一优选实施例中底物液用于检测γ-干扰素浓度(lnx)-发光值(lny)校准曲线图。

图4为本发明实施例4中按发光时间-各时间段发光值绘图的结果图。

图5为本发明实施例4中按发光时间-各时间段两种发光液发光值相对于初始发光值的百分比绘制图的结果图。

具体实施方式

在本发明采用酚酞作为协同增强剂，由于酚酞含有两个酚羟基；吐温-20作为稳定剂，吐温-20可保证氧化剂缓慢释放。

以下将结合附图和具体实施例对本发明进行详细的说明，应当理解，以下所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明的技术方案，并不用于对本发明的限定。下面实施例中如无特别说明的实验方法是按常规实验方法；试验试剂如无特别说明均为市售购买产品。

实施例1

一种稳定的hrp酶促化学发光底物液，分别配置1000ml发光剂溶液和氧化剂溶液，其中，发光剂溶液具体配方如下：

氧化剂溶液具体配方如下：

上述发光剂溶液中，所用的缓冲液可采用其他常规缓冲液系统，如磷酸盐缓冲液等。

在使用前，将所述发光剂溶液和所述氧化剂溶液按体积比1:1混合后使用。以上所述的化学发光底物液混合后1天空白值未升高，信号值稳定。

为了保证上述试剂长期存放后，试剂的稳定性，可在氧化剂溶液中添加质量浓度为0.01～0.1％的proclin300，此质量浓度有效保证了溶液的保质期限，也不会影响试剂的反应效果。

实施例2

本实施例在实施1的基础上配置化学发光底物液和氧化剂溶液，具体配方如下：

化学发光底物液中的发光剂溶液：

鲁米诺1mmol/l

酚酞0.1mmol/l

对碘苯酚1.5mmol/l

0.2mol/l硼酸-硼砂缓冲液，用盐酸调节ph值至9.6。

化学发光底物液中的氧化剂溶液：

0.2mol/l柠檬酸缓冲液，用盐酸调节ph值至5.0

将上述配置的发光剂溶液和氧化剂溶液按照体积比为1:1混合后，作为发光底物液与对照市售进口thermofisherpierce生产的超灵敏发光底物液在测定0.5μg/ml的hrp酶溶液中的信噪比(发光值与背景值的比值)和30分钟发光值的稳定性(各时间段发光值相对于初始发光值的百分比)。

具体步骤：将50μl浓度为0.5μg/ml的hrp酶溶液加入发光板中，预留一孔不加酶溶液作为空白孔，分别将市售进口的发光液和本发明中上述制备的发光底物液加入以上各孔，放入化学发光检测仪读数，每隔1分钟读数一次。

按发光时间-各时间段两种发光液发光值相对于初始发光值的百分比绘制图，绘制好结果图如图1所示；

按发光时间-各时间段两种发光液信噪比绘制图，结果如图2所示。

由图中可看出，本实施例中的发光液信噪比明显优于进口对照发光液，平台期稳定性也稍优于进口对照发光液。

实施例3

采用实施例2中的化学发光底物液，应用于双抗夹心法检测γ-干扰素，其中，抗体采用武汉海吉力生物科技有限公司生产的抗体。

实验步骤如下：

1、加样

(1)使用校准品稀释液将γ-干扰素校准品参考品稀释成12.5pg/ml、25pg/ml、50pg/ml、100pg/ml、200pg/ml、400pg/ml共6个稀释浓度，各取50μl，按顺序加入板孔中，平行做两孔；空白对照1孔，空白对照加校准品稀释液50μl；

(2)每孔加入酶标试剂50μl；

2、温育：轻轻混合均匀，于37℃的恒温培养箱中温育1小时；

3、洗涤：甩掉孔内的液体，每孔加入300μl的1×洗涤液洗涤，拍干，重复5次；

4、发光：每孔加入100μl发光剂混合液；

5、测定：在20分钟内用化学发光免疫分析仪读取发光值；

以上述本发明发光底物液γ-干扰素浓度-发光值数据行进线性拟合：ln(x)-ln(y)，拟合方程：y＝1.540x+3.584，其中，相关系数r²＝0.998。本实施例中底物液γ-干扰素浓度(lnx)-发光值(lny)校准曲线图，如图3所示。

结果说明本发明试剂可用于试剂盒检测，线性好。

实施例4

在实施例2的基础上，配制发光剂a1(不含酚酞)，配制氧化剂b1(不含吐温-20)，将实施例2中的发光剂、氧化剂标记为发光剂a，氧化剂b。

发光剂a1溶液：

鲁米诺1mmol/l

对碘苯酚1.5mmol/l

0.2mol/l硼酸-硼砂缓冲液，用盐酸调节ph值至9.6。

氧化剂b1溶液：

过氧化脲1mmol/l

乙二胺四乙酸二钠(edta)0.04％

proclin3000.05％

0.2mol/l柠檬酸缓冲液，用盐酸调节ph值至5.0

将发光剂a与氧化剂b，发光剂a1与氧化剂b，发光剂a与氧化剂b1分别1:1混合，分别测定0.5μg/ml的hrp酶溶液中的信噪比(发光值与背景值的比值)和30分钟发光值的稳定性(各时间段发光值相对于初始发光值的百分比)。

具体步骤：将50μl浓度为0.5μg/ml的hrp酶溶液加入发光板中，预留一孔不加酶溶液作为空白孔，分别将市售进口的发光液和本发明中上述制备的发光底物液加入以上各孔，放入化学发光检测仪读数，每隔1分钟读数一次。

按发光时间-各时间段发光值绘图，绘制好结果图如图4；按发光时间-各时间段两种发光液发光值相对于初始发光值的百分比绘制图，绘制好结果图如图5。

由图4可看出不加酚酞作为协同增强剂，发光液发光强度较弱。由图5可看出，加入稳定剂吐温-20，发光液的发光值稳定性明显得到提高，协同增强剂同样有稳定发光值的作用。