本发明涉及体外诊断试剂领域，具体涉及一种抑制类风湿因子干扰的胶乳增强免疫比浊试剂盒。
背景技术：
目前，体液标志蛋白的检测方法主要采用免疫学方法，以酶联免疫吸附测定(enzyme-linkedimmol/lunosorbentassay，elisa)、放射免疫测定(radioimmol/lunoassay，ria)和胶体金层析法(俗称“金标”)这几种方法为主。elisa方法虽然在临床上使用了近二十年，但它依然存在一些致命缺点，定量准确性差、操作时间长、自动化程度低，一般只能用于定性检测。ria灵敏度高，但不稳定，重复性比elisa差，而且存在放射性污染的危险。金标方法虽然稳定性较好，但灵敏度较低，只能定性，不能定量。特别是重复性差这一缺点限制了这些检测技术在临床上的应用，尤其不适合用于需要通过准确定量来帮助对疾病进行诊断的体液标志蛋白的定量检测。因此，寻找更加稳定、准确的血浆蛋白定量检测方法一直是国际上近十年来的研究热点。
胶乳颗粒增强比浊法(petia)是近年来出现的一种较为稳定、准确的体液蛋白均相免疫比浊检测方法。基本原理是在高分子胶乳微球的表面交联抗体，当交联有抗体的微球与抗原结合后，在短时间内会迅速聚集在一起，改变了反应液的散光性能或透光性能。而且，反应液散光性能或透光性能(即吸光度)的改变与被测抗原的浓度有较强的相关性，在一定范围内可以反映被测抗原的浓度。petia检测方法是在均相反应体系中进行抗原、抗体反应及结果的测定。抗原、抗体反应后，直接测定反应液的吸光度值，省却了elisa法反复孵育和洗板等烦琐操作步骤，几分钟就能获得结果，省时省力。此外，纳米免疫比浊法操作步骤的简化也相应地避免了许多人为操作因素和试剂、环境等外界因素的干扰，稳定性和重复性都较好，能较真实地反映被测物质的含量。免疫比浊法的灵敏度虽然比elisa法差一些，但足以检测到健康人血浆中许多标志蛋白的下限值，可完全满足临床检测要求。
目前，petia检测试剂所采用的乳胶颗粒多为惰性微球、羧基化微球及氨基化微球。表面修饰的胶乳粒子与抗体的结合是通过其表面的羧基或氨基与抗体的氨基端共价结合，在微球与抗体之间有一个桥联化学臂，降低了位阻效应，不仅提高了抗体的结合率，而且还为抗体提供合适的三维空间立体结构，有效地保护了抗体与抗原结合的活性区域。国外已有多家公司提供纳米级表面修饰的微球粒子原料，并广泛应用于petia。这些厂家提供的粒子直径从20nm－4μm，检测的灵敏度得到了极大的改善，检测灵敏度最高可达到1.0ng/ml。可以作为多克隆抗体和单克隆抗体的载体。纳米级粒子的推出解决了对单克隆抗体结合的能力不强，临床检测的线性范围窄，干扰因素多，实验稳定性差等问题，大大促进了免疫比浊法在临床上的广泛应用。
胶乳增强免疫比浊法常规检测的一个限制是易于受到由可能存在于测试样品中的嗜异性抗体引起的干扰，尤其是类风湿因子引起的干扰。类风湿因子(rheumatoidfactor,rf)是在类风湿性关节炎(ra)病人血清中发现，是一种以变性igg为靶抗原的自身抗体，主要存在于类风湿性关节炎患者的血清和关节液中，它是一种抗变性igg的抗体，属igm型。可与iggfc段结合。ra病人和约50％的健康人体内都存在有产生rf的b细胞克隆，在变性igg(或与抗原结合的igg)或eb病毒直接作用下，可大量合成rf。在商业免疫类检测试剂中所采用的抗体大多是动物来源的igg类抗体，fc段与人igg的fc段具有较高的同源性，能被rf识别并结合，所以在待测物质为阴性、rf阳性的检测样本中，免疫检测试剂有可能被rf捕获产生信号，从而导致假阳性结果。
目前在现有的免疫检测试剂研制中，减少类风湿因子或异嗜性干扰的方法通常有：(1)从样品中去除干扰性的免疫球蛋白或使其失活。比如使用igg固相吸附剂吸附样本中的类风湿因子，或使用含有2-巯基乙醇的稀释液稀释样本，以降解igm型类风湿因子，但这会使检测操作复杂化，并且有可能在去除干扰蛋白的同时也减少了待测物质的含量或活性。(2)使用减少干扰的封闭剂，大多为igg，市场上有许多商品化的封闭剂。但由于类风湿因子或异嗜性抗体的多样化，以及各种产品所使用的抗体不同，目前尚未有一种产品可以有效消除所有干扰，通常需要使用不同产品进行组合、筛选，不但增加工作量、挺高试剂成本，另一方面由于使用多种不明成分的封闭剂，也不可控制地引入新的干扰检测结果的因素。(3)修饰测定抗体以使其更不易与类风湿因子反应。目前最常使用的一种方法是将检测igg抗体酶切去除fc片段，用f(ab’)2替代完整的igg，既保留其识别结合抗体的活性，又消除fc的干扰，减少试剂的非特异性反应。但在igg的酶切、纯化制备工艺中会损失一部分抗体且对抗体活性也有一定程度影响，提高试剂成本，更重要的是试剂制备过程进一步复杂，对控制试剂批间差设置了不可逾越的障碍，从而限制了此类试剂在临床上的推广。
现有的胶乳增强免疫比浊法试剂盒，一般包括试剂1和试剂2，试剂1为促进抗原和抗体反应的缓冲液，试剂2为包被有抗体的胶乳颗粒分散液。
技术实现要素：
为解决上述问题，本发明提供一种抑制类风湿因子干扰的胶乳增强免疫比浊试剂盒，该试剂盒组成简单，针对胶乳增强免疫比浊试剂具有广泛的通用性，可以有效地消除类风湿因子的干扰，提高检测结果的特异性和准确性。
本发明提供一种抑制类风湿因子干扰的胶乳增强免疫比浊试剂盒，它包括试剂1和试剂2，所述试剂1为促进抗原和抗体反应的溶液，所述试剂2为包被有抗体致敏的胶乳颗粒分散液，所述试剂1中包含1-40g/l的n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)，优选地为5-30g/l、10-20g/l、10-30g/l或20-40g/l的n-羟基琥珀酰亚胺。在一些实施方式中，试剂1中n-羟基琥珀酰亚胺的量可以是1g/l、2g/l、3g/l、4g/l、5g/l、6g/l、7g/l、8g/l、9g/l、10g/l、11g/l、12g/l、13g/l、14g/l、15g/l、16g/l、17g/l、18g/l、19g/l、20g/l、21g/l、22g/l、23g/l、24g/l、25g/l、26g/l、27g/l、28g/l、29g/l、30g/l、31g/l、32g/l、33g/l、34g/l、35g/l、36g/l、37g/l、38g/l、39g/l或40g/l。
在一种实施方式中，所述试剂1中包括缓冲液、生物防腐剂、表面活性剂和igm抗体；和所述试剂2中包括缓冲液、生物防腐剂、表面活性剂、封闭剂和稳定剂。
缓冲液可以为本领域中常规使用的缓冲溶液。在一些实施方式中，所述缓冲溶液可以各自独立地为mops、good's缓冲液、三羟甲基氨基甲烷缓冲液、磷酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液以及其任意组合。
在一些实施方式中，所述生物防腐剂可以为二氯乙酰胺、咪唑烷基脲、生物防腐剂proclin系列、山梨酸钾、苯甲酸钠、尼泊金酯等或其任意组合。
在一些实施方式中，所述表面活性剂可以是可以为tween、span、triton、emulgen系列表面活性剂，例如吐温20、吐温40、tx100等等。
封闭剂的作用是为了与胶乳颗粒中游离的-cooh位点结合，避免游离的羧基位点对检测结果造成不良影响，本发明试剂2中封闭剂可以是各种蛋白质，优选bsa蛋白作为封闭剂。
稳定剂的主要作用是保护抗体的活性及防止胶乳颗粒的凝集、下沉，同时还可以增加试剂盒中各组分的稳定性，延长产品的货架期及开瓶后使用时间。常用的稳定剂为糖类、醇类、蛋白类以及一些氨基酸等。在一些实施方式中，稳定剂为糖类，例如蔗糖或海藻糖。
在一种实施方式中，所述试剂1中包括25-200mmol/l磷酸盐缓冲液、0.9-120g/l的氯化钠、0.5-200mg/l抗人igm抗体、0.1-5g/l生物防腐剂proclin300和1-20g/l的表面活性剂tx100。
在一些实施方式中，试剂1中磷酸盐缓冲液浓度可以为25-100mmol/l或100-200mmol/l。在一些实施方式中，试剂1中氯化钠的量是0.9-30g/l、30-120g/l、30-60g/l或60-80g/l。在一些实施方式中，试剂1中抗人igm抗体的量是0.5-50mg/l、50-100mg/l、100-200mg/l或50-200mg/l。在一些实施方式中，试剂1中生物防腐剂的量是0.1-1g/l、1-3g/l、或1-5g/l。在一些实施方式中，试剂1表面活性剂剂的量是1-3g/l、1.5-3g/l、1.5-20g/l或3-20g/l。
在一种实施方式中，所述试剂1中包括100mmol/l磷酸盐缓冲液、30g/l的氯化钠、50mg/l抗人igm抗体、1g/l生物防腐剂proclin300和3g/l的表面活性剂tx100。
在一种实施方式中，所述试剂2中包括20-200mmol/l甘氨酸缓冲液、0.1-5g/l的生物防腐剂proclin300、1-20g/l的表面活性剂tx100、1-5g/l牛血清白蛋白、1-200g/l海藻糖和2-50g/l的抗体致敏的胶乳颗粒。
在一些实施方式中，试剂2中甘氨酸缓冲液浓度可以为20-50mmol/l、50-200mmol/l或100-200mmol/l。
在一些实施方式中，试剂2中稳定剂的量是1-3g/l、1-150g/l、3-150g/l或150-200g/l。在一些实施方式中，试剂2中生物防腐剂的量是0.1-1g/l、1-3g/l、或1-5g/l。在一些实施方式中，试剂2中表面活性剂剂的量是1-3g/l、1.5-3g/l、1.5-20g/l或3-20g/l。在一些实施方式中，试剂2中封闭剂的量是1-2g/l、1-3g/l、2-5g/l或3-5g/l。在一些实施方式中，试剂2中抗体致敏的胶乳颗粒的浓度为0.2-0.5g/l或0.5-5g/l。
在一种实施方式中，所述试剂2中包括50mmol/l甘氨酸缓冲液、1g/l的生物防腐剂proclin300、3g/l的表面活性剂tx100、3g/l牛血清白蛋白、3g/l海藻糖和0.5g/l的抗体致敏的胶乳颗粒。
在一种实施方式中，所述胶乳增强免疫比浊试剂盒致敏胶乳上包被的是动物抗人igg多克隆或单克隆抗体。
在一种实施方式中，所述动物的种属包括兔、山羊、绵羊、鸡和鼠。
在一种实施方式中，所述胶乳增强免疫比浊试剂盒包括：β2微球蛋白测定试剂盒、胱抑素c测定试剂盒、肌红蛋白测定试剂盒、超敏c-反应蛋白测定试剂盒、视黄醇结合蛋白测定试剂盒、α1微球蛋白测定试剂盒、脂蛋白(a)测定试剂盒、d-二聚体测定试剂盒、血清淀粉样蛋白a测定试剂盒、免疫球蛋白e(ige)测定试剂盒、肌钙蛋白测定试剂盒。
在一种实施方式中，本发明提供上述试剂盒的应用，样品的体积与试剂的体积比为1:10-1:150；样品是血清或血浆。
本发明采用在试剂1中添加nhs，加入nhs后，样品中rf因子与抗人igg结合的能力减低，而标记抗体与待测抗原的结合能力不受影响。此外，试剂1中的抗人igm抗体，能够与减活后的rf因子结合，从而彻底消除rf因子对测定结果的干扰。因此，本发明的试剂盒能够提高检测结果的特异性和准确性；另外本试剂盒组成简单，具有较高的灵敏度，具有广泛的通用性。
具体实施方式
为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合下面结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。
本发明方案广泛通用地适用于多种胶乳增加免疫比浊试剂盒，包括而不限于采用胶乳增强免疫比浊法的β2微球蛋白测定试剂盒、胱抑素c测定试剂盒、肌红蛋白测定试剂盒和超敏c-反应蛋白测定试剂盒四种检测试剂的应用以说明本发明方案的优越性，但是这四种举例并非用于限制本发明方案的保护范围，需要表明的是本方案对包括上述试剂在内绝大多数胶乳增加免疫比浊试剂均具有良好的通用性。
实施例一:β2微球蛋白测定试剂盒中试验
1.含有不同nhs量的β2微球蛋白测定试剂1
β2微球蛋白测定试剂1-a：25mmol/l磷酸盐缓冲液，0.9g/l的氯化钠，0.5mg/l羊抗人igm抗体，0.1g/l生物防腐剂proclin300，1g/l表面活性剂tx100，0g/lnhs；
β2微球蛋白测定试剂1-b、c、d、e、f、g、h和i中各组分与试剂1-a相同，除了nhs浓度不同，它们分别为1g/lnhs、5g/lnhs、10g/lnhs、20g/lnhs、30g/lnhs、40g/lnhs、45g/lnhs和50g/lnhs。
2.β2微球蛋白测定试剂2：20mmol/l甘氨酸缓冲液，0.2g/l抗人β2微球蛋白多克隆抗体致敏的胶乳颗粒，0.1g/l生物防腐剂proclin300，1g/l表面活性剂tx100，1g/l牛血清白蛋白，1g/l海藻糖。
3.含有不同类风湿因子含量的β2微球蛋白样本制备：在含有3.15g/l的β2微球蛋白纯品的样品中分别加入不同的rf，配制成含有0、100、200、500、1000iu/mlrf的溶液。
以上配制的九种β2微球蛋白测定试剂(1-a，1-b，1-c，1-d，1-e，1-f，1-g，1-h，1-i，各试剂的nhs量不同)，对含有0、100、200、500、1000iu/ml的rf的β2微球蛋白样本进行检测。
表1：β2微球蛋白测定试剂盒试验结果
以上数据可知：试剂1中无nhs时，测定结果明显随着rf因子含量增加而升高，由最初的3.15mg/l升高到28.31mg/l，试剂1中添加nhs可以明显减少rf因子的干扰，当nhs含量为20g/l时，rf因子对测定结果影响基本没有。但当nhs量逐渐增加到45g/l、50g/l时，测定结果明显偏低，显示为副干扰。
另外，发明人对于试剂2和试剂1中不同物质的量也进行了研究，发现在试剂2中20-200mmol/l甘氨酸缓冲液、0.1-5g/l的生物防腐剂proclin300、1-20g/l的表面活性剂tx100、1-5g/l牛血清白蛋白、1-200g/l海藻糖和2-50g/l的抗体致敏的胶乳颗粒；和/或，试剂1中25-200mmol/l/l磷酸盐缓冲液、0.9-120g/l的氯化钠、0.5-200mg/l羊抗人igm抗体、0.1-5g/l生物防腐剂proclin300和1-20g/l的表面活性剂tx100，结果同表1中类似。
实施例二:胱抑素c测定试剂盒中试验
1.含有不同nhs量的胱抑素c测定试剂1
胱抑素c测定试剂1-a：200mmol/l磷酸盐缓冲液，120g/l的氯化钠，200mg/l羊抗人igm抗体，0g/lnhs，生物防腐剂proclin3005g/l，表面活性剂tx1002g/l
胱抑素c测定试剂1-b、c、d、e、f、g、h和i中各组分与试剂1-a相同，除了nhs浓度不同，它们分别为1g/lnhs、5g/lnhs、10g/lnhs、20g/lnhs、30g/lnhs、40g/lnhs、45g/lnhs和50g/lnhs。
2.胱抑素c测定试剂盒测定试剂2：200mmol/l甘氨酸缓冲液，5.0g/l抗人胱抑素c多克隆抗体致敏的胶乳颗粒，5g/l生物防腐剂proclin300，2g/l表面活性剂tx100，5g/l牛血清白蛋白，200g/l海藻糖。
3.含有不同类风湿因子含量的胱抑素c样本制备：在含有0.92mg/l的胱抑素c纯品的样品中分别加入不同的rf，配制成含有0、100、200、500、1000iu/mlrf的溶液。
以上配制的九种胱抑素c测定试剂(1-a，1-b，1-c，1-d，1-e，1-f，1-g，1-h，1-i，各试剂的nhs量不同)，对含有0、100、200、500、1000iu/ml的rf的胱抑素c样本进行检测。
表2：胱抑素c测定试剂盒中试验结果
以上数据可知：试剂1中无nhs时，测定结果明显随着rf因子含量增加而升高，由最初的0.92mg/l升高到6.43mg/l。试剂1中添加nhs可以明显减少rf因子的干扰，当nhs含量为20g/l时，rf因子对测定结果影响基本没有。但当nhs量逐渐增加到45g/l、50g/l时，测定结果明显偏低，显示为副干扰。
此外，发明人对于试剂2和试剂1中不同物质的量也进行了研究，发现在试剂2中20-200mmol/l甘氨酸缓冲液、0.1-5g/l的生物防腐剂proclin300、1-20g/l的表面活性剂tx100、1-5g/l牛血清白蛋白、1-200g/l海藻糖和0.2-5g/l的抗体致敏的胶乳颗粒；和/或，试剂1中25-200mmol/l磷酸盐缓冲液、0.9-120g/l的氯化钠、0.5-200mg/l羊抗人igm抗体、0.1-5g/l生物防腐剂proclin300和1-20g/l的表面活性剂tx100，结果同表2中类似。
实施例三:超敏c-反应蛋白测定试剂盒中试验
1.含有不同nhs量的超敏c-反应蛋白测定试剂盒测定试剂1
超敏c-反应蛋白测定试剂盒测定试剂1-a：100mmol/l磷酸盐缓冲液，30g/l的氯化钠，50mg/l羊抗人igm抗体，1g/l生物防腐剂proclin300，3g/l表面活性剂tx100，0g/lnhs；
超敏c-反应蛋白测定试剂1-b、c、d、e、f、g、h和i中各组分与试剂1-a相同，除了nhs浓度不同，它们分别为1g/lnhs、5g/lnhs、10g/lnhs、20g/lnhs、30g/lnhs、40g/lnhs、45g/lnhs和50g/lnhs。
2.超敏c-反应蛋白测定试剂盒测定试剂2：50mmol/l甘氨酸缓冲液，0.5g/l抗人超敏c-反应蛋白多克隆抗体致敏的胶乳颗粒，1g/l生物防腐剂proclin300，3g/l表面活性剂tx100，3g/l牛血清白蛋白，3g/l海藻糖。
3.含有不同类风湿因子含量的超敏c-反应蛋白测定试剂盒样本制备：在含有2.60g/l的超敏c-反应蛋白测定试剂盒纯品的样品中分别加入不同的rf，配制成含有0、100、200、500、1000iu/mlrf的溶液。
以上配制的九种超敏c-反应蛋白测定试剂盒测定试剂(试剂1-a，1-b，1-c，1-d，1-e，1-f，1-g，1-h，1-i，各试剂的nhs量不同)，对含有0、100、200、500、1000iu/ml的rf的超敏c-反应蛋白测定试剂盒样本进行检测。
表3：超敏c-反应蛋白测定试剂盒中试验结果
以上数据可知：试剂1中无nhs时，测定结果明显随着rf因子含量增加而升高，由最初的2.60mg/l升高到40.43mg/l。试剂1中添加nhs可以明显减少rf因子的干扰，当nhs含量为20g/l时，rf因子对测定结果影响基本没有。但当nhs量逐渐增加到45g/l、50g/l时，测定结果明显偏低，显示为副干扰。
此外，发明人对于试剂2和试剂1中不同物质的量也进行了研究，发现在试剂2中20-200mmol/l甘氨酸缓冲液、0.1-5g/l的生物防腐剂proclin300、1-20g/l的表面活性剂tx100、1-5g/l牛血清白蛋白、1-200g/l海藻糖和0.2-5g/l的抗体致敏的胶乳颗粒；和/或，试剂1中25-200mmol/l磷酸盐缓冲液、0.9-120g/l的氯化钠、0.5-200mg/l羊抗人igm抗体、0.1-5g/l生物防腐剂proclin300和1-20g/l的表面活性剂tx100，结果同表3中类似。
实施例四:肌红蛋白测定试剂盒中试验
1.含有不同nhs量的肌红蛋白测定试剂盒测定试剂1
肌红蛋白测定试剂盒测定试剂1-a：26mmol/l磷酸盐缓冲液，120g/l的氯化钠，50mg/l羊抗人igm抗体，1g/l生物防腐剂proclin300，1g/l表面活性剂tx100，0g/lnhs；
肌红蛋白测定试剂1-b、c、d、e、f、g、h和i中各组分与试剂1-a相同，除了nhs浓度不同，它们分别为1g/lnhs、5g/lnhs、10g/lnhs、20g/lnhs、30g/lnhs、40g/lnhs、45g/lnhs和50g/lnhs。
2.肌红蛋白测定试剂盒测定试剂2：200mmol/l甘氨酸缓冲液，0.2g/l抗肌红蛋白多克隆抗体致敏的胶乳颗粒，5g/l生物防腐剂proclin300，1.5g/l表面活性剂tx100，2g/l牛血清白蛋白，150g/l海藻糖。
3.含有不同类风湿因子含量的肌红蛋白测定试剂盒样本制备：在含有85.32g/l的肌红蛋白测定试剂盒纯品的的样品中分别加入不同的rf，配制成含有0、100、200、500、1000iu/mlrf的溶液。
以上配制的九种肌红蛋白测定试剂盒测定试剂(试剂1-a，1-b，1-c，1-d，1-e，1-f，1-g，1-h，1-i，各试剂的nhs量不同)，对含有0、100、200、500、1000iu/ml的rf的肌红蛋白测定试剂盒样本进行检测。
表4肌红蛋白测定试剂盒中试验结果
以上数据可知：试剂1中无nhs时，测定结果明显随着rf因子含量增加而升高，由最初的85.32mg/l升高到400.25mg/l。试剂1中添加nhs可以明显减少rf因子的干扰，当nhs含量为20g/l时，rf因子对测定结果影响基本没有。但当nhs量逐渐增加到45g/l、50g/l时，测定结果明显偏低，显示为副干扰。
此外，发明人对于试剂2和试剂1中不同物质的量也进行了研究，发现在试剂2中20-200mmol/l甘氨酸缓冲液、0.1-5g/l的生物防腐剂proclin300、1-20g/l的表面活性剂tx100、1-5g/l牛血清白蛋白、1-200g/l海藻糖和0.2-5g/l的抗体致敏的胶乳颗粒；和/或，试剂1中25-200mmol/l磷酸盐缓冲液、0.9-120g/l的氯化钠、0.5-200mg/l羊抗人igm抗体、0.1-5g/l生物防腐剂proclin300和1-20g/l的表面活性剂tx100，结果同表4中类似。
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。