一种ASE‑HPLC法测定马鞭草中齐墩果酸和熊果酸总含量的方法与流程

本发明属于化学检测领域，尤其是一种ase-hplc法测定马鞭草中齐墩果酸和熊果酸含量的方法。
背景技术：
：马鞭草为马鞭草科植物的干燥地上部分。其性凉，味苦，无毒；具有清热解毒、破血通经、活血散瘀、利尿消肿的功效。研究表明，马鞭草具有明显抗炎、抗早孕及抗人绒毛膜癌的作用，进一步研究得知，其抗癌的有效成分为齐墩果酸和熊果酸。齐墩果酸和熊果酸为同分异构体，结构与性质均极其相似，在天然植物中往往共生互存，分离测定较为困难。2005年版的《中国药典》(一部)采用薄层扫描色谱法测定马鞭草中熊果酸含量，此法受薄层板、温度、点样、显色等诸多因素影响，易导致定量分析结果偏差，且无法准确测定出另外一种有效成分—齐墩果酸的含量。技术实现要素：针对上述不足，本发明旨在提供一种可同时测定马鞭草中齐墩果酸和熊果酸含量，且操作简便、灵敏度高、稳定性良好的ase-hplc法。为了实现上述技术效果，本发明提供的技术方案是这样的：一种ase-hplc法测定马鞭草中的齐墩果酸和熊果酸总含量的方法，依次包括下述步骤：步骤1：采用ase法用甲醇对粉碎后的马鞭草进行萃取，收集甲醇萃取液；步骤2：采用hplc法测定马鞭草中齐墩果酸和熊果酸的含量，其中所用色谱柱为thermoacclaimc30。进一步的，步骤2所述的色谱柱的规格为3μm，2.1*150mm。进一步的，所述的步骤1包括下述子步骤：步骤s1：将马鞭草样品粉碎过三号筛，取0.25g与1g硅藻土混合；步骤s2：将步骤1所得混合物放于装有纤维滤膜的10mlase萃取池，加硅藻土至与池口平行；步骤s3：用25ml甲醇进行萃取，结束后用甲醇定容至25ml，得甲醇萃取液。进一步的，步骤s3所述的萃取，参数如下：萃取温度为100℃，萃取时间为6min，萃取次数为1次，压力为1500psi，冲洗体积为60％，吹扫时间为60s。进一步的，步骤2所述的hplc法的检测参数如下：柱温为40℃；流速为0.3ml/min；流动相为甲醇-0.2％醋酸；检测波长为205nm。进一步的，所述的流动相的甲醇-0.2％醋酸的体积比为90:10。进一步的，所述的ase法所使用的仪器为美国dionex公司的ase350快速溶剂萃取仪、hplc法所采用的仪器为安捷伦-1290高效液相色谱仪。本发明与传统方法相比，具有以下优点：1.本发明曾对快速溶剂萃取使用的溶剂进行考察，有论文提到使用70％乙醇提取齐墩果酸和熊果酸相对含量较高，故对使用甲醇和70％乙醇和无水乙醇进行了溶剂考察，结果显示甲醇、70％乙醇和无水乙醇提取齐墩果酸和熊果酸含量一致，且杂质峰基本相同，故采用甲醇作为提取溶剂；2.本发明考察了萃取次数对其影响，实验中取样品对其进行萃取1次、2次、3次，分析其结果，结果表明萃取一次几乎完全，故实验采用萃取一次的方法；3.本发明提高了温度降低溶剂的黏度，减少了溶剂进入样品基体的阻止，增加了溶剂进入样品基体的扩散，降低溶剂和样品基体之间的表面张力，使溶剂溶解待测物的容量增加；4.由于液体对溶质的溶解能力远大于气体对溶质的溶解能力，故萃取液体的沸点随压力升高而提高，从而使溶剂在高温高压下仍保持在液态。附图说明图1为齐墩果酸对照品和熊果酸对照品混合液的色谱图；图2为采用ase-hplc法测定的样品中齐墩果酸和熊果酸的色谱图；图3为采用药典方法测定的样品中齐墩果酸和熊果酸的色谱图。具体实施方式下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何在本发明权利要求保护范围内所做的有限次修改，仍在本发明的权利要求保护范围内。实施例11.仪器设备及试剂1.1仪器：电子分析天平(xa205du)、ase350快速溶剂萃取仪(美国dionex公司)、高效液相色谱仪(1290)1.2试剂(除特别注明外，本实验所用试剂均为分析纯)：水：符合gb/t6682规定的一级水；甲醇(ch4o)：色谱纯(液相色谱用)；乙醇(c2h5oh)：分析纯。2方法2.1对照品溶液的制备：取齐墩果酸对照品、熊果酸对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含齐墩果酸50μg、熊果酸0.1mg的混合溶液，即得。2.2供试品溶液的制备2.2.1《中国药典》2015年版一部制备供试品方法：取本品粉末(过四号筛)约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入无水乙醇25ml，称定重量，加热回流4小时，放冷，再称定重量，用无水乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液10ml，加1％氨水溶液3ml，混匀，用石油醚(30～60℃)振摇提取3次，每次15ml，弃去石油醚液，取乙醇液蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。2.2.2快速溶剂萃取法(ase)制备供试品方法：样品经粉碎机粉碎，过三号筛，取0.25g，精密称定，与约1g硅藻土混合均匀，待用，移入到预先放好纤维滤膜的ase10ml萃取池中再加入适量硅藻土，轻轻振摇使之与池口在同一水平线上，拧紧萃取池上盖，放入快速萃取仪中进行萃取。萃取结束后，把萃取液转移至25ml容量瓶中，用少量甲醇清洗萃取瓶3次合并至容量瓶中，使用甲醇定容至刻度，即得。2.3ase萃取条件所述的萃取，参数如下：萃取温度为100℃，萃取时间为6min，萃取次数为1次，压力为1500psi，冲洗体积为60％，吹扫时间为60s。2.4色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-0.2％醋酸溶液(82.5:17.5)为流动相；蒸发光散射检测器检测。理论板数按熊果酸峰计算应不低于5000。2.5测定法照高效液相色谱法(通则0512)测定分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。检测参数如下：仪器：安捷伦-高效液相色谱仪(1290)；色谱柱为thermoacclaimc30，3μm，2.1*150mm；柱温为40℃；流速为0.3ml/min；流动相为体积比为90:10的甲醇-0.2％醋酸；检测波长为205nm。2.6标准限值要求本品按干燥品计算，含齐墩果酸(c30h48o3)和熊果酸(c30h48o3)的总量不得少于0.30％。2.7计算(外标法)式中cr——对照品溶液浓度，单位为微克每升(mg/l)；ax——供试品的峰面积；ar——对照品峰面积。注意：使用前萃取池底部应拆卸清理干净，否则容易引起压力不稳；萃取池底部的滤纸应在密封圈内，否则引起渗漏；萃取池装样时松紧适中，太松容易导致提取液过多；开机前检查气瓶气压是否达到1mpa；使用结束后清理干净，萃取池要及时晾干(容易生锈)。3结果3.1色谱图图1为齐墩果酸对照品和熊果酸对照品混合液的色谱图；图2为采用ase-hplc法测定的样品中齐墩果酸和熊果酸的色谱图；图3为采用药典方法测定的样品中齐墩果酸和熊果酸的色谱图。其中，在图1-3中齐墩果酸的保留时间为5.424min、熊果酸的保留时间为5.907。3.2重复性试验取相同批号的样品(批号：20150801)0.5g，共6份，精密称定，按ase提取方法提取供试品溶液，进样量为3μl，以上述的色谱条件平行试验，测得样品中齐墩果酸和熊果酸含量的含量见表1，rsd为2.4％，试验表明ase提取方法重复性良好。表13.3样品含量测定结果(3批)本发明分别使用了两台快速溶剂萃取仪及药典方法对马鞭草样品进行提取，提取结果见表2：表2ase1与药典方法提取样品中齐墩果酸和熊果酸总含量的数据对比结果见表3：表3批号ase1药典平均值rad％150628010.3680.3160.3427.6015071030.4140.3550.3857.67201508010.4000.3430.3727.67ase2与药典方法提取样品中齐墩果酸和熊果酸总含量的数据对比结果见表4：表4批号ase2药典平均值rad％150628010.3850.3160.3519.8415071030.4010.3550.3786.08201508010.3820.3430.3635.38两台ase仪器间的数据对比见表5：表5批号ase1ase2平均值rad％150628010.3680.3850.3772.2615071030.4140.4010.4081.60201508010.4000.3820.3912.304讨论4.1ase提取溶剂的选择：试验中，曾对快速溶剂萃取使用的溶剂进行考察，有论文提到使用70％乙醇提取齐墩果酸和熊果酸相对含量较高，故对使用甲醇和70％乙醇和无水乙醇进行了溶剂考察，结果显示甲醇、70％乙醇和无水乙醇提取齐墩果酸和熊果酸含量一致，且杂质峰基本相同，故采用甲醇作为提取溶剂。4.2ase提取条件的优化在上述实验基础上，本实验主要考察萃取次数对其影响，实验中取样品对其进行萃取1次、2次、3次，分析其结果，结果表明萃取一次几乎完全。故实验采用萃取一次的方法。当前第1页12