一种快速溶剂萃取‑电雾式检测器同时测定酸枣仁中四种成分的方法与流程

本发明涉及一种同时测定酸枣仁中多钟成分的含量的方法，尤其是一种快速溶剂萃取-电雾式检测器同时测定酸枣仁中四种成分的方法，属于化学检测技术领域。

背景技术：

酸枣仁为鼠李科枣属植物酸枣ziziphusjujubamill.var.spinosa(bunge)huexh.f.chou的干燥成熟种子。具养心补肝，宁心安神，敛汗，生津之功效，常用于虚烦不眠，惊悸多梦，体虚多汗，津伤口渴。其主要的有效化学成分为三萜皂苷类、黄酮类、三萜类、生物碱等。具有镇静催眠、抗焦虑、抗惊厥、抗炎、抗肿瘤等作用。《中国药典》2015年版一部酸枣仁含量测定的提取方法为传统索氏提取法，该方法操作繁琐、耗时长；快速溶剂萃取(ase)是指在密闭容器内于高温(50～200℃)和高压(500～3000psi)条件下，在短时间内用有机溶剂提取固体或半固体样品的一种新型样品前处理方法。与超声、微波、回流、超临界萃取等成熟方法相比，ase有萃取溶剂用量少、提取时间短、萃取效率高、操作简单方便、安全和自动化程度高等优点。国外已有学者将这项技术应用于植物药定量和定性分析中样品的前处，但在中药材有效成分的定量和定性分析中作为样品的前处理方法应用较少，本研究尝试将其应用到酸枣仁含量测定中以避免传统方法的上述缺陷。

电雾式检测器(cad)是一款新型的通用型检测器，它基于雾化检测器的原理，洗脱液经雾化后形成颗粒，经过漂移管干燥后与带电氮气碰撞，使得目标化合物带上正电荷，最后通过静电计测量电荷的量，该测量值与目标化合物的质量成一定比例关系，其响应不依赖于化合物的分子结构，能对大多数化合物提供一致响应性，同时能达到较高的灵敏度和低检测极限、重现性、稳定性较好，因此能准确的用于定量分析。对于酸枣仁中有效成分的测定，传统方法多采用液相二极管阵列检测器、蒸发光检测器和液相质谱检测系统^[15-16]，然而酸枣仁皂苷a、b与白桦脂酸为三萜皂苷类成分，紫外吸收差，使用二极管阵列检测器灵敏度低，而蒸发光散色检测器(elsd)检测基线不够稳定、灵敏度也难以满足要求；液相质谱检测系统虽然灵敏度较高，但是仪器价格高、操作复杂、维护不易。电雾式检测器是一种基于质量的灵敏检测器，尤其适于测定与化学特性无关的任何不挥发分析物，该技术的灵敏度和精度比蒸发光散射检测的高，重复性好，可达到纳克级灵敏度，因此使用电雾式检测器进行酸枣仁中多种有效成分的检测具有很大的实际应用前景。

技术实现要素：

针对上述技术问题，本发明的目的是同时提供一种建立了同时测定酸枣仁中2种皂苷类、1种黄酮类和1种三萜类成分含量的方法，该方法高效准确、重现性好。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是这样的：

一种快速溶剂萃取-电雾式检测器同时测定酸枣仁中四种成分的方法，依次包括下述步骤：

1)对照品储备液的制备

分别精密称取酸枣仁皂苷a、酸枣仁皂苷b、斯皮诺素、白桦脂酸对照品适量，加甲醇溶解并定容至刻度，制成质量浓度分别为酸枣仁皂苷a4.1802mg.ml^-1、酸枣仁皂苷b5.088mg.ml^-1、斯皮诺素4.7304mg.ml^-1、白桦脂酸4.272mg.ml^-1的对照品储备液，于冰箱中保存，备用；

2)供试品溶液的制备

取本品粉末1g，精密称定，与1g硅藻土混合均匀填充于10ml萃取池，按ase正交设计优化的条件进行先除杂再提取，除杂过程：用正己烷在80℃静态萃取8min，循环萃取1次，萃取液弃去并氮气吹扫300s；提取过程：萃取溶剂为甲醇，萃取温度100℃，静态萃取时间8min，萃取循环次数为1次，冲洗体积60％，氮气吹扫时间为60s；得到25ml萃取液回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；

3)色谱条件及系统适应性试验

注入色谱仪检测，色谱柱thermosyncronisc18(，流动相为乙腈-水，梯度洗脱程序为0～8min，10％～60％乙腈；8～10min，60％～80％乙腈；10～13min，80％～100％乙腈；13～16min，100％乙腈；流速0.5ml.min^-1，柱温40℃，雾化温度35℃，进样量1μl。

本发明与现有技术相比，具有以下优势：

本发明提供的技术方案方法建立一种快速溶剂萃取(ase)-电雾式检测器(cad)同时测定酸枣仁中酸枣仁皂苷a、酸枣仁皂苷b、斯皮诺素、白桦脂酸的方法。优化了ase参数，极大地提高了提取效率，通过1次进样，同时测定酸枣仁中2种皂苷类、1种黄酮类和1种三萜类成分的含量，线性关系良好，相关系数为0.9983～0.9996，回收率在98.46％～102.02％之间。该方法快速、简便、准确可靠，可用于酸枣仁药材的质量控制。

附图说明

图1混合对照品hplc图

图2是酸枣仁样品的hplc图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明的权利要求书做进一步说明，但不构成对本发明的任何限制，任何对本发明做有限次修改可得的技术方案仍然属于本发明所要保护的范围。

实施例1

1仪器与试药

1.1仪器

thermofisherscitificultimate3000高效液相色谱仪配置电雾式检测器coronaultra(赛默飞世尔科技公司)、ase350快速溶剂萃取仪(赛默飞世尔科技公司)、xa205du电子分析天平(梅特勒仪器有限公司)，超纯水机(默克密理博公司)，ev311-v旋转蒸发仪(北京莱伯泰科科技有限公司)。

1.2试药

对照品酸枣仁皂苷a(批号110734-201512，含量以95.6％计)、酸枣仁皂苷b(批号110814-200506，含量以100％计)、斯皮诺素(批号111869-201203，含量以95.4％计)、白桦脂酸(批号111802-201001，含量以100％计)均由中国食品药品检定研究院提供；乙腈为色谱级，其余试剂均为分析纯。

酸枣仁药材均为市售品(批号1508015、1511018，产地河北；批号150401产地山东；批号150802、151110，产地江西；1511003、151008、151112，产地山东；1508003、151003，产地云南)，经广西梧州食品药品检验所黄蘅副主任中药师鉴定为鼠李科植物酸枣的干燥成熟种子。

2方法

2.1对照品储备液的制备

分别精密称取酸枣仁皂苷a、酸枣仁皂苷b、斯皮诺素、白桦脂酸对照品适量，加甲醇溶解并定容至刻度，制成质量浓度分别为酸枣仁皂苷a4.1802mg.ml^-1、酸枣仁皂苷b5.088mg.ml^-1、斯皮诺素4.7304mg.ml^-1、白桦脂酸4.272mg.ml^-1的对照品储备液，于冰箱中保存，备用。

2.2供试品溶液的制备

取本品粉末(过四号筛)约1g，精密称定，与约1g硅藻土混合均匀填充于10ml萃取池，按ase正交设计优化的条件进行先除杂再提取，除杂过程：用正己烷在80℃静态萃取8min，循环萃取1次，萃取液弃去并氮气吹扫300s；提取过程：萃取溶剂为甲醇，萃取温度100℃，静态萃取时间8min，萃取循环次数为1次，冲洗体积60％，氮气吹扫时间为60s。得到约25ml萃取液回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至5ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3色谱条件及系统适应性试验

色谱柱thermosyncronisc18(100mm×3mm,3μm，美国赛默飞世尔科技公司)，流动相为乙腈-水，梯度洗脱程序为0～8min，10％～60％乙腈；8～10min，60％～80％乙腈；10～13min，80％～100％乙腈；13～16min，100％乙腈；流速0.5ml.min^-1，柱温40℃，雾化温度35℃，进样量1μl。各成分色谱峰计算的理论塔板数均≥4000。见图1和图2，其中：1-酸枣仁皂苷a，2-酸枣仁皂苷b，3-斯皮诺素，4-白桦脂酸。

3结果

3.1ase正交试验及结果分析

3.1.1除杂溶剂和萃取溶剂的选择

《中国药典》2015年版采用石油醚作为除杂溶剂，本试验同时考察了石油醚、正己烷的除杂效果，通过hplc-cad检测对杂质峰高和数量进行比较，确定选择正己烷为除杂溶剂，同时使用单因素考察确定除杂的ase条件：萃取温度80℃，静态萃取时间8min，萃取循环次数为1次，氮气吹扫时间为300s以吹扫干正己烷。

根据待测成分的溶解性考察了甲醇、70％乙醇作为萃取溶剂，结果显示甲醇与70％乙醇提取斯皮诺素含量一致，且杂质峰基本相同，考虑到甲醇更易于浓缩蒸干，故采用甲醇提取溶剂。

3.1.2ase萃取条件正交试验的设计和结果分析

影响快速溶剂萃取的因素主要有萃取温度、静态萃取时间、冲洗体积和循环次数，本研究以酸枣仁皂苷a、酸枣仁皂苷b、斯皮诺素、白桦脂酸的萃取含量以及四种成分的萃取总量为考察指标，在单因素实验中对萃取温度(60℃～180℃)、冲洗体积(60％～100％)、静态萃取时间(5min～10min)和循环次数(1～5次)进行初步筛选，确定冲洗体积为60％，进一步优化的萃取温度范围为80℃～120℃，静态萃取时间为6min～10min，循环次数为1～3次。再采用l9(3³)正交设计表优化，各试验条件下重复2次。因素水平正交试验设计表见表1，正交试验结果分析见表2。表2的正交试验结果可见，从各指标成分的极差来看，影响萃取效率最明显的是温度，其次是静态萃取时间，影响各指标成分萃取含量较优水平依次为：斯皮诺素a2、b2、c1或c3；酸枣仁皂苷aa2、b1或b2、c1或c3；酸枣仁皂苷ba2、b1或b2、c1或c3；白桦脂酸a2、b3、c2；四种成分总量a2、b2或b3、c2。综合指标成分的萃取效率及考虑节约溶剂和时间，最终选择ase的萃取条件为萃取溶剂甲醇，萃取温度100℃，静态萃取时间8min，萃取循环次数为1次，冲洗体积60％，氮气吹扫时间为60s。

表1l9(3³)正交试验设计ta

表2正交试验结果分析

3.2线性关系考察

分别精密量取对照品储备液0.4、0.8、1.2、1.6、2ml至10ml量瓶中，加甲醇至刻度，配制成一系列线性浓度，进样量为1μl，在上述色谱条件下测定其峰面积，以各成分进样量(μg)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程及相关系数，结果表明四种成分在0.2μg～1μg范围内与峰面积呈良好线性关系，见表3。

表3酸枣仁中四种成分回归方程和线性范围

3.3精密度试验

取上述对照品溶液(浓度约为0.4mg.ml^-1)，连续进样6次，记录峰面积，酸枣仁皂苷a、酸枣仁皂苷b、斯皮诺素、白桦脂酸峰面积的rsd依次为0.15％、0.41％、0.30％、0.23％、0.37％，表明仪器精密度良好。

3.4重复性试验

取酸枣仁样品(批号1508015)，按“2.3”项下方法制备6份供试品溶液，按上述色谱条件进行测定，计算酸枣仁皂苷a、酸枣仁皂苷b、斯皮诺素、白桦脂酸含量分别为3.39mg.g^-1、2.86mg.g^-1、1.63mg.g^-1、1.07mg.g^-1，rsd依次为0.72％、1.02％、0.87％、0.51％，表明方法重复性良好。

3.5稳定性试验

取重复性试验供试品溶液，分别于0、4、8、12、16、20、24h进样，记录峰面积，计算酸枣仁皂苷a、酸枣仁皂苷b、斯皮诺素、白桦脂酸峰面积的rsd依次为0.38％、0.92％、0.43％、0.57％，表明供试品溶液在24h内稳定。

3.6加标回收率试验

取已测定的酸枣仁样品(批号1508015)6份，每份1g，精密称定，精密加入酸枣仁皂苷a、酸枣仁皂苷b、斯皮诺素、白桦脂酸对照储备液适量，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在上述色谱条件进行测定，分别计算酸枣仁皂苷a、酸枣仁皂苷b、斯皮诺素、白桦脂酸的平均回收率依次为102.02％、98.46％、101.16％、100.93％，rsd依次为1.82％、1.07％、1.93％、1.17％，表明该方法的准确度良好。

3.7检出限和定量限的测定

取对照品溶液(浓度约为0.2mg.ml^-1)逐级稀释，测定酸枣仁皂苷a、酸枣仁皂苷b、斯皮诺素、白桦脂酸峰高，分别以信噪比(s/n)等于3和10为标准，测得4个待测成分的检出限和定量限，本试验方法检出限酸枣仁皂苷a为0.7μg.ml^-1、酸枣仁皂苷b0.8μg.ml^-1、斯皮诺素0.8μg.ml^-1、白桦脂酸0.7μg.ml^-1；定量限酸枣仁皂苷a为2.4μg.ml^-1、酸枣仁皂苷b2.6μg.ml^-1、斯皮诺素2.6μg.ml^-1、白桦脂酸2.4μg.ml^-1。

3.8样品测定以及不同提取方法的比较

取不同批次的酸枣仁粉末1g，精密称定，分别按“2.2”项下以及《中国药典》2015版一部酸枣仁项下方法制备供试品溶液，分别按各自方法色谱条件下进行分析测定，取两种方法得到的含量结果进行t检验，根据t值表，所得t值＜t(df)0.05＝1.833，即两种方法的统计学差异不显著，结果见表4。

表410批样品不同提取方法的含量比较

4讨论

本研究采用快速溶剂萃取(ase)法进行酸枣仁中有效成分的提取，以酸枣仁皂苷a、酸枣仁皂苷b、斯皮诺素、白桦脂酸的萃取含量以及四种成分的萃取总量为指标，采用l9(3³)正交试验优化萃取温度、静态萃取时间和循环次数等ase的主要影响因素，与《中国药典》传统方法相比，除杂和提取过程能在一小时内完成，大大缩短了样品前处理时间。两种提取方法测得的各成分含量基本一致，快速溶剂萃取(ase)法操作方便，安全性好、自动化程度高并且环保。

cad为通用型检测器，其检测信号对不同结构的化合物有一致的响应，研究显示，酸枣仁有效成分标准曲线在较小范围内，cad检测器的响应值与化合物质量呈直线关系，可采用外标两点法计算，比较方便。与药典方法中蒸发光检测器(elsd)相比(检测限约为20μg.ml^-1)，灵敏度更高，基线更稳定，利于定量分析。

目前对酸枣仁的质量研究只是局限于仅对酸枣仁皂苷类或斯皮诺素进行研究，本文建立的ase-hplc-cad方法能够同时测定酸枣仁中2种皂苷类、1种黄酮类和1种三萜类成分的含量，拓展了酸枣仁质量研究的应用范围。该方法简便、快速、准确，可实现对酸枣仁多组分的质量控制，为ase延伸到中药检测的提取提供了理论基础；同时也可利用cad特性，尝试开发酸枣仁及其类似药材的的一测多评方法用于全面评价和分析药材的质量

以上所述的仅为本发明的较佳实施例，凡在本发明的精神和原则范围内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。