基于壳聚糖‑铂模拟氧化酶的酸性磷酸酶测定方法与流程

本发明涉及壳聚糖-铂模拟氧化酶催化显色体系的酸性磷酸酶及其抑制剂的测定方法，属于分析化学和纳米技术领域。

背景技术：

酸性磷酸酶是一种在酸性条件下催化磷酸单酯水解生成无机磷酸的一种水解酶，广泛分布在一些植物或是哺乳动物的组织中。农业方面，酸性磷酸酶对判断农作物生长的最适ph有重要作用。医学方面，其可作为肝炎、甲状旁腺功能亢进、红血球病变等疾病的重要诊断指标。因此，酸性磷酸酶含量的测定有着深远意义。但目前酸性磷酸酶的测定还存在诸多局限，例如，现有方法主要选用4-硝基苯磷酸二钠作为底物，然而水解反应产生的硝基苯需要在碱性条件下才有比较强的信号，这与酸性磷酸酶的最适催化条件（ph=5.0）相矛盾。故发展一种更有效、准确的比色方法来测定酸性磷酸酶具有非常重要的实际意义。

酸性磷酸酶在温度为37℃，ph为5.0的条件下可以水解抗坏血酸磷酸酯，生成抗坏血酸。而具有强还原型的抗坏血酸可以抑制氧化酶对3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐的催化氧化作用，使得3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色不明显。酸性磷酸酶的含量越高，体系的吸收度值越小。基于此，可实现对酸性磷酸酶进行定量测定。

本发明以抗坏血酸磷酸酯为酸性磷酸酶底物，以壳聚糖-铂模拟氧化酶催化氧化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色体系为检测信号源，建立了一种比色测定酸性磷酸酶的方法。酸性磷酸酶催化水解反应和壳聚糖-铂模拟氧化酶催化氧化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色反应可在同一ph下进行。该方法简便、快捷，不涉及任何复杂、贵重的仪器，检测成本低。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种利用壳聚糖-铂模拟氧化酶催化氧化3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐显色体系，以抗坏血酸磷酸酯为底物，从而测定酸性磷酸酶及其抑制剂的方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

本发明所述的基于壳聚糖-铂模拟氧化酶的酸性磷酸酶测定方法，其特征是在抗坏血酸磷酸酯和酸性磷酸酶反应产物中加入3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液和壳聚糖-铂模拟氧化酶溶液，反应后加入硫酸溶液终止反应，根据溶液颜色和紫外吸收光谱特征的变化，用于酸性磷酸酶含量的测定；所使用的壳聚糖-铂模拟氧化酶是用壳聚糖作为稳定剂，硼氢化钠还原氯铂酸得到，具体合成步骤如下：称取0.1g壳聚糖溶解于50ml浓度为1v/v%的醋酸中，搅拌15分钟使壳聚糖完全溶解即得到浓度为0.2m/v%的壳聚糖溶液，将2ml浓度为10mmol/l氯铂酸加入到47ml浓度为0.2m/v%壳聚糖溶液中，搅拌30分钟，然后逐滴加入1ml浓度为0.2mol/l新配制的硼氢化钠溶液并在5分钟之内加完，置于暗处搅拌90分钟，得到壳聚糖-铂模拟氧化酶，所得产物避光冷藏保存。

所述的基于壳聚糖-铂模拟氧化酶的酸性磷酸酶测定方法，其特征是将50μl浓度为4mmol/l的抗坏血酸磷酸酯和50μl不同浓度的酸性磷酸酶加入到200μlph为5，浓度为50mmol/l的醋酸盐缓冲液中，混合均匀后在37℃下反应30分钟，然后依次加入632.5μlph为5，浓度为50mmol/l的醋酸盐缓冲液、50μl浓度为3mmol/l的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液和17.5μl壳聚糖-铂模拟氧化酶溶液，混合均匀后再在37℃下反应5分钟，加入200μl浓度为2mol/l的硫酸溶液终止反应，测定溶液的吸光度值a450。

所述的基于壳聚糖-铂模拟氧化酶的酸性磷酸酶测定方法，其特征是在在0.25~2.5u/l范围内，吸光度变化值△a450与酸性磷酸酶浓度呈线性关系，检测限为0.0161u/l。

本发明所述的基于壳聚糖-铂模拟氧化酶的测定人血清酸性磷酸酶的方法，其特征是包括如下步骤：将50μl浓度为4mmol/l的抗坏血酸磷酸酯和50μl人血清加入到200μlph为5，浓度为50mmol/l的醋酸盐缓冲液中，混合均匀后在37℃下反应30分钟，依次将632.5μlph为5，浓度为50mmol/l的醋酸盐缓冲液、50μl浓度为3mmol/l的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液和17.5μl壳聚糖-铂模拟氧化酶溶液加入到上述反应液中，混合均匀后再在37℃下反应5分钟，加入200μl浓度为2mol/l的硫酸溶液终止反应，测定溶液的吸光度值a450，根据酸性磷酸酶标准曲线计算人血清中的碱性磷酸酶含量；所使用的壳聚糖-铂模拟氧化酶是用壳聚糖作为稳定剂，硼氢化钠还原氯铂酸得到，具体合成步骤如下：称取0.1g壳聚糖溶解于50ml浓度为1v/v%的醋酸中，搅拌15分钟使壳聚糖完全溶解即得到浓度为0.2m/v%的壳聚糖溶液，将2ml浓度为10mmol/l氯铂酸加入到47ml浓度为0.2m/v%壳聚糖溶液中，搅拌30分钟，然后逐滴加入1ml浓度为0.2mol/l新配制的硼氢化钠溶液并在5分钟之内加完，置于暗处搅拌90分钟，得到壳聚糖-铂模拟氧化酶。

所述的基于壳聚糖-铂模拟氧化酶的测定人血清酸性磷酸酶的方法，其特征是得人血清样品测定的回收率为97.4%~107.8%，相对标准偏差为2.4~6.4%。

本发明所述的基于壳聚糖-铂模拟氧化酶的酸性磷酸酶抑制剂的测定方法，其特征是在抗坏血酸磷酸酯、酸性磷酸酶和酸性磷酸酶抑制剂的反应产物中加入3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液和壳聚糖-铂模拟氧化酶溶液，反应后加入硫酸溶液终止反应，根据溶液颜色和紫外吸收光谱特征的变化，用于碱性磷酸酶抑制剂抑制率的测定；所使用的壳聚糖-铂模拟氧化酶是用壳聚糖作为稳定剂，硼氢化钠还原氯铂酸得到，具体合成步骤如下：称取0.1g壳聚糖溶解于50ml浓度为1v/v%的醋酸中，搅拌15分钟使壳聚糖完全溶解即得到浓度为0.2m/v%的壳聚糖溶液，将2ml浓度为10mmol/l氯铂酸加入到47ml浓度为0.2m/v%壳聚糖溶液中，搅拌30分钟，然后逐滴加入1ml浓度为0.2mol/l新配制的硼氢化钠溶液并在5分钟之内加完，置于暗处搅拌90分钟，得到壳聚糖-铂模拟氧化酶。

所述的基于壳聚糖-铂模拟氧化酶的酸性磷酸酶抑制剂的测定方法，其特征是将50μl浓度为4mmol/l的抗坏血酸磷酸酯和50μl浓度为0.1u/ml的酸性磷酸酶溶液加入到200μl含不同浓度氟化钠的ph为5，浓度为50mmol/l的醋酸盐缓冲液中，混合均匀后在37℃下反应30分钟，依次加入632.5μlph为5，浓度为50mmol/l的醋酸盐缓冲液、50μl浓度为3mmol/l的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液和17.5μl壳聚糖-铂模拟氧化酶溶液，混合均匀后再在37℃下反应5分钟，加入200μl浓度为2mol/l的硫酸溶液终止反应，测定溶液的吸光度值a450，计算抑制率，通过软件拟合得到氟化钠的ic50为0.896mmol/l。

具体地说，本发明采用如下技术方案：

（一）壳聚糖-铂模拟氧化酶的制备：称取0.1g壳聚糖溶解于50ml浓度为1%（v/v）的醋酸中，搅拌15分钟使壳聚糖完全溶解即得到浓度为0.2%（m/v）的壳聚糖溶液。将2ml浓度为10mmol/l氯铂酸加入到47ml浓度为0.2%壳聚糖溶液中，搅拌30分钟，然后逐滴加入1ml浓度为0.2mol/l新配制的硼氢化钠溶液（5分钟之内加完），置于暗处搅拌90分钟，得到壳聚糖-铂模拟氧化酶，所得产物避光冷藏保存。

（二）酸性磷酸酶的测定：将50μl浓度为4mmol/l的抗坏血酸磷酸酯和50μl不同浓度的酸性磷酸酶加入到200μl醋酸盐缓冲液（ph5，50mmol/l）中，混合均匀后在37℃下反应30分钟；依次加入632.5μl醋酸盐缓冲液（ph5，50mmol/l）、50μl浓度为3mmol/l的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液和17.5μl步骤（一）制备的壳聚糖-铂模拟氧化酶溶液，混合均匀后再在37℃下反应5分钟，加入200μl浓度为2mol/l的硫酸溶液终止反应，测定溶液在450nm波长处的吸光度值（a450），绘制标准曲线进行酸性磷酸酶含量测定。

（三）酸性磷酸酶抑制剂的测定：将50μl浓度为0.1u/ml的酸性磷酸酶溶液和50μl浓度为4mmol/l抗坏血酸磷酸酯溶液加入到200μl含不同浓度氟化钠的醋酸盐缓冲溶液中（ph5，50mmol/l），摇匀后在37℃下反应30分钟。依次加入632.5μl醋酸盐缓冲液（ph5，50mmol/l）、50μl浓度为3mmol/l的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液和17.5μl步骤（一）制备的壳聚糖-铂模拟氧化酶溶液，混合均匀后再在37℃下反应5分钟，加入200μl浓度为2mol/l的硫酸溶液终止反应，测定溶液吸光度值a450。通过软件拟合，得到氟化钠的半抑制浓度ic50。

本发明的优点

（1）本发明利用酸性磷酸酶水解抗坏血酸磷酸酯生成抗坏血酸，从而抑制壳聚糖-铂模拟氧化酶催化显色反应体系，结合溶液颜色和紫外吸收光谱特征的变化，直接用于酸性磷酸酶及其抑制剂含量的测定。

（2）本发明制备的壳聚糖-铂模拟氧化酶由壳聚糖作为稳定剂，硼氢化钠还原氯铂酸得到，其制备过程简单快速。

（3）本发明检测步骤简单，不涉及任何复杂、贵重的仪器，检测成本低。

（4）本发明检测灵敏度高，酸性磷酸酶的检测限为0.0161u/l。

附图说明

图1为外观图。图中的a对照组：壳聚糖-铂模拟氧化酶+3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐；图中的b对照组:壳聚糖-铂模拟氧化酶+3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐+抗坏血酸磷酸酯；图中的c对照组:壳聚糖-铂模拟氧化酶+3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐+酸性磷酸酶；图中的d实验组：壳聚糖-铂模拟氧化酶+3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐+抗坏血酸磷酸酯+酸性磷酸酶。

图2为紫外吸收光谱图。图中的a对照组：壳聚糖-铂模拟氧化酶+3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐；图中的b对照组:壳聚糖-铂模拟氧化酶+3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐+抗坏血酸磷酸酯；图中的c对照组:壳聚糖-铂模拟氧化酶+3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐+酸性磷酸酶；图中的d实验组：壳聚糖-铂模拟氧化酶+3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐+抗坏血酸磷酸酯+酸性磷酸酶。

图3为酸性磷酸酶浓度与壳聚糖-铂模拟氧化酶催化显色体系吸光度值a450的线性关系图。

图4为酸性磷酸酶测定干扰实验。数字0~11依次分别代表空白、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、焦磷酸水解酶、乙酰胆碱酯酶、α-葡萄糖苷酶、胆碱氧化酶、蛋白酶k、过氧化氢酶、溶菌酶和脲酶。

图5为氟化钠抑制率曲线图。

具体实施方式

实施例1：

称取0.1g壳聚糖溶解于50ml浓度为1%（v/v）的醋酸中，搅拌15分钟使壳聚糖完全溶解即得到浓度为0.2%（m/v）的壳聚糖溶液。将2ml浓度为10mmol/l氯铂酸加入到47ml浓度为0.2%（m/v）壳聚糖溶液中，搅拌30分钟，然后逐滴加入1ml浓度为0.2mol/l新配制的硼氢化钠溶液（5分钟之内加完），置于暗处搅拌90分钟，得到深褐色的壳聚糖-铂模拟氧化酶溶液。产物避光冷藏保存。以上过程中使用的所有玻璃器皿均经过王水浸泡，并用双蒸水彻底清洗，晾干。

实施例2：

将50μl浓度为4mmol/l的抗坏血酸磷酸酯和50μl浓度为0.1u/ml的酸性磷酸酶加入到200μl醋酸盐缓冲液（ph5，50mmol/l）中，混合均匀后在37℃下反应30分钟。依次加入632.5μl醋酸盐缓冲液（ph5，50mmol/l）、50μl浓度为3mmol/l的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液和17.5μl实施例1制得的壳聚糖-铂模拟氧化酶溶液，混合均匀后再在37℃下反应5分钟，加入200μl浓度为2mol/l的硫酸溶液终止反应，目视观察颜色的变化或测定溶液的紫外-可见吸收光谱。目视观察颜色变化时，对照组溶液颜色均为深黄色，实验组溶液颜色变为无色（见图1）。测定紫外-可见吸收光谱时，对照组的吸收光谱几乎不发生变化，而实验组的吸收光谱在350~550nm区域的吸收明显减小（见图2）。

实施例3：

将50μl浓度为4mmol/l的抗坏血酸磷酸酯和50μl不同浓度的酸性磷酸酶加入到200μl醋酸盐缓冲液（ph5，50mmol/l）中，混合均匀后在37℃下反应30分钟。依次加入632.5μl醋酸盐缓冲液（ph5，50mmol/l）、50μl浓度为3mmol/l的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液和17.5μl实施例1制得的壳聚糖-铂模拟氧化酶溶液，混合均匀后再在37℃下反应5分钟，加入200μl浓度为2mol/l的硫酸溶液终止反应，测定溶液的吸光度值a450。由图3可知，随着酸性磷酸酶浓度的增大，吸光度值a450的变化值（△a450）逐渐增大。在0.25~2.5u/l范围内，△a450与酸性磷酸酶浓度呈线性关系，最低检测限为0.0161u/l。

实施例4：

将50μl浓度为4mmol/l的抗坏血酸磷酸酯和50μl浓度为0.0125u/ml的酸性磷酸酶加入到200μl醋酸盐缓冲液（ph5，50mmol/l）中，混合均匀后在37℃下反应30分钟。依次加入632.5μl醋酸盐缓冲液（ph5，50mmol/l）、50μl浓度为3mmol/l的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液和17.5μl实施例1制得的壳聚糖-铂模拟氧化酶溶液，混合均匀后再在37℃下反应5分钟，加入200μl浓度为2mol/l的硫酸溶液终止反应，测定溶液的吸光度值a450。重复上述实验步骤9次，得相对标准偏差（rsd）为3.9%，表明本方法重现性良好。

实施例5：

取正常人血清，与不同浓度的酸性磷酸酶按照1:4的体积比充分混合，得到样品溶液。将50μl浓度为4mmol/l的抗坏血酸磷酸酯和50μl上述样品溶液加入到200μl醋酸盐缓冲液（ph5，50mmol/l）中，混合均匀后在37℃下反应30分钟。在上述反应液中依次加入632.5μl醋酸盐缓冲液（ph5，50mmol/l）、50μl浓度为3mmol/l的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液和17.5μl实施例1制得的壳聚糖-铂模拟氧化酶溶液，混合均匀后再在37℃下反应5分钟，加入200μl浓度为2mol/l的硫酸溶液终止反应，测定溶液的吸光度值a450。结合实施例3计算正常人血清中酸性磷酸酶的含量，测定回收率为97.4%~107.8%，相对标准偏差为2.4~6.4%。

实施例6：

酸性磷酸酶测定干扰实验：将50μl浓度为4mmol/l的抗坏血酸磷酸酯和50μl浓度为1u/ml其他酶溶液加入到200μl醋酸盐缓冲液（ph5，50mmol/l）中，混合均匀后在37℃下反应30分钟。依次加入632.5μl醋酸盐缓冲液（ph5，50mmol/l）、50μl浓度为3mmol/l的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液和17.5μl实施例1制得的壳聚糖-铂模拟氧化酶溶液，混合均匀后再在37℃下反应5分钟，立即加入200μl浓度为2mol/l的硫酸溶液终止反应，测定溶液的吸光度值a450。由图4可知，即使其他酶的浓度比酸性磷酸酶高10倍，仍不能产生明显的干扰，表明本方法对酸性磷酸酶具有良好的选择性。

实施例7：

将50μl浓度为4mmol/l的抗坏血酸磷酸酯和50μl浓度为0.1u/ml的酸性磷酸酶溶液加入到200μl含不同浓度氟化钠的醋酸盐缓冲液（ph5，50mmol/l）中，混合均匀后在37℃下反应30分钟。依次加入632.5μl醋酸盐缓冲液（ph5，50mmol/l）、50μl浓度为3mmol/l的3，3’，5，5’-四甲基联苯胺盐酸盐溶液和17.5μl实施例1制得的壳聚糖-铂模拟氧化酶溶液，混合均匀后再在37℃下反应5分钟，加入200μl浓度为2mol/l的硫酸溶液终止反应，测定溶液的吸光度值a450，计算抑制率。结果如图5所示，通过软件拟合得到氟化钠的ic50为0.896mmol/l。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。