定量检测污泥中含硫氨基酸的方法与流程

技术领域：
：本发明属于化学分析检测领域，其是一种操作相对简便、毒性小、成本低、准确性高、灵敏度高的定量检测污泥中含硫氨基酸的方法。
背景技术：
：：近年来，污水处理厂引发的恶臭问题越来越引起人们的重视。其中，含硫物质在导致恶臭的产生中起到重要作用。在污水处理厂中，厌氧消化过程中所产生的挥发性有机硫（voscs），如甲硫醇（mm）、二甲基硫醚（dms）等，无机硫，如硫化氢（h2s）等已被确定为引起恶臭的最主要物质。这类物质臭阈值极低，且其产生的恶臭非常严重，即使微量的vocs和h2s也能对恶臭污染产生极大的贡献。研究表明，在市政污泥的厌氧消化阶段，形成voscs的前体物质主要为半胱氨酸（cys）和甲硫氨酸（met）。在厌氧条件下，这些含硫的前体物质经过一系列机制，如，生物还原、水解、甲基化、金属催化氧化等转化为voscs和h2s。met会产生mm，mm经过两条途径转化为h2s：其一，不经dms过程直接由mm转化为h2s；其二，先由mm氧化为dms，dms再通过产甲烷菌作用产生h2s。而cys不参与中间voscs的形成，直接经微生物作用产生h2s。因此，明确硫元素在厌氧消化过程中的物质流，为后续控制恶臭过程提供理论依据，必需建立适当的方法定量检测污泥中的cys和met。含硫氨基酸的检测主要有液相色谱法、离子色谱法、气相色谱法、电化学法、毛细管电泳法等。其中，高效液相色谱法和离子色谱法较为常用。其中，由离子色谱原理制造的氨基酸分析仪是目前国家标准中规定使用的分析仪器。但由于氨基酸分析仪专属性强、检测成本高，故使用的普及率较低。目前针对含硫氨基酸的检测主要集中于食品及医学领域，针对复杂的环境样品，如污水和污泥中含硫氨基酸的检测尚未见报道。技术实现要素：：本发明是为了弥补当前污泥物料中含硫氨基酸检测的空缺和技术问题，提供一种切实可行、检测成本低、灵敏度高、准确性高、毒性小的定量检测复杂环境样品污泥中含硫氨基酸的方法。本发明的技术解决方案是：定量测定污泥中含硫氨基酸的方法，按如下步骤进行：a.将污泥样品于冷干机冷干，用球磨机对冷干样品进行研磨，而后过筛，低温保存；b.将含半胱氨酸、蛋氨酸的污泥样品经过甲酸氧化，制备性质稳定的磺基丙氨酸和蛋氨酸砜；c.用浓盐酸对污泥氧化液进行水解，水解液经3kd滤膜超滤，去除污泥中大分子杂质，纯化氨基酸；d.将污泥中的氨基酸与衍生剂邻苯二甲醛进行衍生反应，生成有荧光吸收的衍生产物；e.将衍生产物用高效液相色谱进行分析，定量检测污泥中的含硫氨基酸。所述步骤a是取污泥40ml于50ml离心管于-20℃冷冻；将冷冻污泥置于冷干机中，在-40℃条件下冷干3天；将污泥冷干样用球磨机于4500rmp条件下粉碎10min;将粉碎后的污泥样品过200目筛，于-50℃冰箱保存。所述步骤b是取a步骤的污泥样品0.0500g于水解管中，加入过甲酸1.5ml，于50℃条件下，水浴氧化30min；向污泥氧化液中加0.4ml偏重亚硫酸钠溶液，终止氧化反应；所述过甲酸溶液是将30%的过氧化氢溶液与88%的甲酸溶液按照体积比为1：9混合，在常温下放置1h制得，此溶液现用现配；所述偏重亚硫酸钠溶液是将33.6g偏重亚硫酸钠加水定容至100ml制得。所述步骤c是向b步骤制得的污泥氧化液中加入5.1ml浓度为8.2mol/l的盐酸溶液；向水解管中通氮气30s，密封水解管，将水解管置于105℃烘箱中水解22h；取出水解管，置于室温冷却，开启水解管，将水解管内污泥水解液移入茄形旋转蒸发瓶中，并用1ml浓度为0.1mol/l盐酸洗出残留水解液，反复三次，将污泥水解液于40℃、-10bar条件下，旋转蒸发至干；用0.1mol/l盐酸将茄形旋转蒸发瓶中的氨基酸样品溶出，并定容至10ml；取定容后的水解液400μl于3kd超滤离心管中，于13805g离心力下离心40min制得污泥氨基酸超滤液；所述8.2mol/l盐酸溶液是将纯盐酸683ml定容至1000ml制得；所述0.1mol/l盐酸溶液是将纯盐酸8.3ml定容至1000ml制得。所述步骤d是将c步骤所得的污泥氨基酸超滤液200μl加入内插管中，依据如下程序步骤进行在线衍生：进样针吸取2.5μl且ph为10.2的硼酸缓冲盐溶液，吸取0.5μl污泥氨基酸超滤液，吸取0.5μl邻苯二甲醛衍生剂，吸取3μl空气以最大速率混合6次；吸取32μl且ph为6.5的二水合磷酸二氢钠稀释液，吸取空气18μl以最大速率混合2次，完成氨基酸衍生过程；所述ph为10.2的硼酸缓冲盐溶液，称取2.50g硼酸，加水溶解，于100ml容量瓶定容得0.4mol/l硼酸溶液，用10mol/l氢氧化钠溶液调ph至10.2；所述10mol/l氢氧化钠溶液，称取40g氢氧化钠，加水溶解，于100ml容量瓶定容制得；所述邻苯二甲醛溶液，称取80.0mg邻苯二甲醛，加7ml硼酸缓冲液溶解，再加1ml乙腈、125μl巯基丙酸混匀；所述ph为6.5的二水合磷酸二氢钠稀释液，称取2.6408g磷酸二氢钾，加水溶解，于1000ml容量瓶定容，用10mol/l氢氧化钠调ph为6.5，再加4ml磷酸。所述步骤e的色谱流相及梯度是：动相a、流动相b、流速、洗脱梯度、激发波长ex=340nm、发射波长em=460nm；所述流动相a是将甲醇、乙腈、水按照体积比为45:45:10混合制得，使用前超声脱气30min；所述流动相b是称取2.6408g磷酸二氢钾，加水溶解，于1000ml容量瓶定容，用10mol/l氢氧化钠调ph为6.5制得，使用前过0.22μm滤膜过滤，超声脱气30min；所述流动相梯度如下表所示：时间（min）流动相a流动相b流速（ml/min）0.000.0100.021.900.0100.0123.1040.060.0123.60100.00.0227.30100.00.0228.200.0100.0229.000.0100.02本发明是将复杂环境样品污泥冷干、过筛保存，检测时将污泥样品中的半胱氨酸或胱氨酸、蛋氨酸经过甲酸氧化，将其转化为磺基丙氨酸和蛋氨酸砜，再经酸水解将氧化产物磺基丙氨酸和蛋氨酸砜从多肽和蛋白质中释放出来，污泥水解样品经超滤除杂提纯，纯化样品与邻苯二甲醛进行在线衍生反应，衍生产物经色谱柱进行高效液相色谱分析。无需使用价格昂贵的氨基酸分析仪，毒性小，切实可行、检测成本低、灵敏度高、准确性高。附图说明：图1本发明标准样品分析图谱。图2本发明污泥样品分突图谱。具体实施方式：下面结合附图说明本发明的具体实施方式：1.仪器设备及试剂安捷伦1260g1321bfld荧光检测器，安捷伦1260g1311c四元泵，安捷伦1260g1329b标准自动进样器，安捷伦1260g1316a柱温箱，安捷伦zorbaxeclipseaaa3.5μm×4.6mm×150mm，烘箱，水解管，电热恒温水浴锅，3kmillipore超滤离心管，高速离心机，旋转蒸发仪，样品瓶，内插管。半胱氨酸标准品、蛋氨酸标准品、磺基丙氨酸标准品及蛋氨酸砜标准品（上海安谱实验科技股份有限公司）、脱水污泥（上海嘉定污水处理厂）、30%过氧化氢、88%过甲酸、盐酸（优级纯）、偏重亚硫酸钠、硼酸、磷酸（hplc级）、邻苯二甲醛（hplc级）、巯基丙酸（hplc级）、二水合磷酸二氢钠（hplc级）等（除特殊说明外，其它均为分析纯）。2.检测方法2.1方法原理污泥中的胱氨酸和半胱氨酸、蛋氨酸经过甲酸氧化后，分别生成性质稳定的磺基丙氨酸和蛋氨酸砜，氧化产物在高温酸水解下从蛋白质和多肽中释放出来，与邻苯二甲醛发生衍生反应生成带荧光特性的衍生产物，衍生产物经高效液相色谱进行定量分析。氧化反应及衍生反应方程式如下：氧化反应方程式：衍生方程式：上述反应方程式表明过甲酸可将胱氨酸的二硫键、半胱氨酸的巯基、蛋氨酸的硫醚键中的硫氧化为硫酰基，而不破坏氨基，邻苯二甲醛在巯基丙酸的参与下与氨基发生衍生反应，生成具有荧光吸收的衍生产物。2.2方法步骤按如下步骤进行：a.取污泥40ml于50ml离心管于-20℃冷冻；将冷冻污泥置于冷干机中，在-40℃条件下冷干3天；将污泥冷干样用球磨机于4500rmp条件下粉碎10min;将粉碎后的污泥样品过200目筛，于-50℃冰箱保存；b.取上述a步骤的污泥样品0.0500g于水解管中，加入过甲酸1.5ml，于50℃条件下，水浴氧化30min；向污泥氧化液中加0.4ml偏重亚硫酸钠溶液，终止氧化反应；所述过甲酸溶液是将30%的过氧化氢溶液与88%的甲酸溶液按照体积比为1：9混合，在常温下放置1h制得，此溶液现用现配；所述偏重亚硫酸钠溶液是将33.6g偏重亚硫酸钠加水定容至100ml制得；c.向上述b步骤制得的污泥氧化液中加入5.1ml浓度为8.2mol/l的盐酸溶液；向水解管中通氮气30s，密封水解管，将水解管置于105℃烘箱中水解22h；取出水解管，置于室温冷却，开启水解管，将水解管内污泥水解液移入茄形旋转蒸发瓶中，并用1ml浓度为0.1mol/l盐酸洗出残留水解液，反复三次，将污泥水解液于40℃、-10bar条件下，旋转蒸发至干；用0.1mol/l盐酸将茄形旋转蒸发瓶中的氨基酸样品溶出，并定容至10ml。取定容后的水解液400μl于3kd超滤离心管中，于13805g离心力下离心40min制得污泥氨基酸超滤液；所述8.2mol/l盐酸溶液是将纯盐酸683ml定容至1000ml制得；所述0.1mol/l盐酸溶液是将纯盐酸8.3ml定容至1000ml制得；d.将上述c步骤所得的污泥氨基酸超滤液200μl加入内插管中，依据如下程序步骤进行在线衍生：进样针吸取2.5μl且ph为10.2的硼酸缓冲盐溶液，吸取0.5μl污泥氨基酸超滤液，吸取0.5μl邻苯二甲醛衍生剂，吸取3μl空气以最大速率混合6次；吸取32μl且ph为6.5的二水合磷酸二氢钠稀释液，吸取空气18μl以最大速率混合2次，完成氨基酸衍生过程；所述ph为10.2的硼酸缓冲盐溶液，称取2.50g硼酸，加水溶解，于100ml容量瓶定容得0.4mol/l硼酸溶液，用10mol/l氢氧化钠溶液调ph至10.2；所述10mol/l氢氧化钠溶液，称取40g氢氧化钠，加水溶解，于100ml容量瓶定容制得；所述邻苯二甲醛溶液，称取80.0mg邻苯二甲醛，加7ml硼酸缓冲液溶解，再加1ml乙腈、125μl巯基丙酸混匀；所述ph为6.5的二水合磷酸二氢钠稀释液，称取2.6408g磷酸二氢钾，加水溶解，于1000ml容量瓶定容，用10mol/l氢氧化钠调ph为6.5，再加4ml磷酸；e.将衍生后的样品进行高效液相色谱分析，色谱流相及梯度是：动相a、流动相b、流速、洗脱梯度、激发波长ex=340nm、发射波长em=460nm；所述流动相a是将甲醇、乙腈、水按照体积比为45:45:10混合制得，使用前超声脱气30min；所述流动相b是称取2.6408g磷酸二氢钾，加水溶解，于1000ml容量瓶定容，用10mol/l氢氧化钠调ph为6.5制得，使用前过0.22μm滤膜过滤，超声脱气30min；所述流动相梯度如表1所示：表13.检测结果3.1磺基丙氨酸和蛋氨酸砜标准品分析检测结果准确称取磺基丙氨酸标准品42.3mg（浓度25nmol/μl）、蛋氨酸砜标准品45.3mg（浓度25nmol/μl），溶于水中，定容至10ml，制备25nmol/μl的标准储备液。使用时，将储备液稀释成系列梯度50、100、200、300、400、500pmol/μl，按2.2方法中d步骤、e步骤进行处理，绘制标准曲线。磺基丙氨酸和蛋氨酸砜标准品（100pmol/μl）分离谱图如图1,图中1为磺基丙氨酸；2为蛋氨酸砜；标准品标准曲线回归方程、线性范围、检出限(三倍信噪比)及定量限（十倍信噪比）见表2：表23.2污泥样品分析结果污泥样品分析图谱见图2，图中1为磺基丙氨酸（胱氨酸及半胱氨酸氧化产物）；2为蛋氨酸砜（蛋氨酸氧化产物）。污泥样品中，磺基丙氨酸、蛋氨酸砜与周围氨基酸分离效果好，其与左右氨基的分离度分别为（-）/13.1、（2.19）/5.6，均符合药典中分离度大于1.5的规定。同一污泥样品，一分为六，采用2.2所述方法连续处理6次，污泥中胱氨酸和蛋氨酸含量结果见表3：表3在同一污泥样品，加入半胱氨酸和蛋氨酸标准品，按2.2方法处理分析样品，计算加标回收率（n=3）。加标回收率结果见表4：表4本发明是将复杂环境样品污泥冷干、过筛保存，检测时将污泥样品中的半胱氨酸或胱氨酸、蛋氨酸经过甲酸氧化，将其转化为磺基丙氨酸和蛋氨酸砜，再经酸水解将氧化产物磺基丙氨酸和蛋氨酸砜从多肽和蛋白质中释放出来，污泥水解样品经超滤除杂提纯，纯化样品与邻苯二甲醛进行在线衍生反应，衍生产物经色谱柱进行高效液相色谱分析。无需使用价格昂贵的氨基酸分析仪，毒性小，切实可行、检测成本低、灵敏度高、准确性高。上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。当前第1页12