密封重水方法及检测多光子成像中多光子信号强度的方法与流程

本发明属于生物光子学技术领域，尤其涉及一种密封重水方法及检测多光子成像中多光子信号强度的方法。

背景技术：

多光子显微成像是一种基于非线性光学效应的成像技术，它在生物医学方面有着十分广泛的应用。多光子成像有两个主要的研究方向，一是保证不损伤生物组织的前提下提高成像深度，二是扩展成像模态从而得到更多样品信息。这两个方向的研究都得益于激光的发展。近来，已经有实验展示了采用1700nm波段高能量孤子激光作为激发光源，通过多光子成像技术可以对活体小鼠的深层脑部组织进行成像，1700nm波段激发的多光子成像是一种能够显著提高组织成像深度和扩展多光子成像模态的显微成像技术。此外，在1700nm波段，二次谐波成像，三光子荧光成像，三次谐波成像，四光子荧光成像[8]，四次谐波成像以及五光子荧光成像都在实验上已有演示。因此，1700nm波段多光子成像极具应用前景。

多光子成像中，一个必不可少的光学元件是高数值孔径的浸润物镜。实验中，浸润介质通常是用来匹配样品组织的折射率以减少成像过程中产生的像差。在对小鼠脑部成像时，一般使用纯水浸润，而在对皮肤组织成像时一般使用油浸润。实验结果表明，尽管成像过程中，浸润介质的厚度很薄(毫米量级)，但它对1700nm波段的吸收是不可忽视的。鉴于产生信号对激发功率的非线性依赖关系，它会导致多光子信号的大幅衰减。所以我们提出了以重水代替纯水浸润的方法，并且在使用油浸润时会谨慎选择激光波长。

目前，在1700nm波段的小鼠脑组织深层成像只能通过重水浸润得到。尽管重水的吸收系数与水相比小了1个数量级[5]，但由于重水的吸水性使得重水在实验过程中会从周围环境吸收水蒸汽，使得它的透过率会随时间而降低，从而导致到达样品上的激发光和多光子信号强度会随着实验时间增加而衰减。这十分不利于基于荧光强度探测的时间动力学测量，比如荧光分子的漂白特性研究和生物样品中荧光分子的标记和清除检测。

为了避免重水的吸水性，最容易想到的方法就是在实验中不断更换重水。然而，这个方法有几个缺点：(1)在更换新的重水之前，必须将先前被水蒸汽污染过的重水小心、完全地移除，保证没有残留。(2)在持续时间较长的成像过程中，比如小鼠大脑的多光子成像(可能会持续5个小时)需要在实验中更换将近9次重水，因为三光子信号经过35分钟后强度会衰减为原来的一半。尽管如此，基于荧光强度的时间动力学测量也不能采用这种方法，因为重水吸收水蒸汽导致信号的衰减会叠加到荧光染料的衰减曲线里，使得实验结果产生误差。

那么，需要提供一种合适的重水密封方法，从而避免因重水的吸水性而导致多光子成像过程中产生的多光子信号强度随时间的增加而衰减。

技术实现要素：

本发明提供一种密封重水方法及检测多光子成像中多光子信号强度的方法，旨在在多光子成像中利用石蜡油密封重水，并通过检测多光子信号强度是否发生变化来判断用石蜡油密封重水的效果。

本发明提供了一种密封重水方法，在重水表面滴石蜡油，使其覆盖在所述重水表面。

进一步地，所述石蜡油的用量和所述重水的用量相等。

本发明还提供了一种检测多光子成像中多光子信号强度的方法，所述方法包括：

在装有待测样品的玻片上滴重水，所述装有待测样品的玻片置于多光子成像系统中；

滴石蜡油在所述重水上，使其覆盖在所述重水表面；

所述多光子成像系统中产生的激发光照射到待测样品上，产生多光子信号，利用所述多光子成像系统中的带通滤光片滤除特定波长的光信号，使所述待测样品产生的多光子信号透过，并利用所述多光子成像系统中的探测器收集所述多光子信号；

基于收集到的所述多光子信号检测所述多光子信号强度，并判断所述多光子信号强度的变化是否在阈值范围内。

进一步地，所述装有待测样品的玻片上固定有橡胶环，所述重水滴在所述橡胶环的环内，防止所述重水扩散；

所述橡胶环的外径为22mm，内径为15.8mm，厚度为3.1mm。

进一步地，所述待测样品为荧光染料，所述多光子信号为三光子荧光信号；所述带通滤光片为第一带通滤光片，用于滤除特定波长的光信号，使所述荧光染料产生的三光子荧光信号透过；所述探测器为镓砷磷探测器，用于收集所述三光子荧光信号。

进一步地，所述待测样品为小鼠脑部白质，所述多光子信号为三次谐波信号；所述带通滤光片为第二带通滤光片，用于滤除特定波长的光信号，使所述小鼠脑部白质产生的三次谐波信号透过；所述探测器为砷化镓探测器，用于收集所述三次谐波信号。

进一步地，所述多光子成像系统沿光路方向包括：飞秒激光器、光子晶体棒、长波通滤光片、多光子显微镜，所述待测样品置于所述多光子显微镜下；

所述飞秒激光器用于产生1550nm飞秒激光脉冲，所述光子晶体棒用于根据耦合入的所述飞秒激光脉冲产生1665nm孤子脉冲，所述长波通滤光片用于滤出1665nm孤子脉冲，并以所述1665nm孤子脉冲作为激发光，所述多光子显微镜用于使所述激发光照射到所述待测样品上，并对所述待测样品进行成像。

进一步地，所述多光子显微镜沿光路方向包括：扫描振镜、扫描透镜、套筒透镜以及水浸物镜。

进一步地，所述多光子成像系统还包括第一透镜、第二透镜和反射镜，所述第一透镜设置于所述飞秒激光器和所述光子晶体棒之间，用于聚焦所述飞秒激光器产生的1550nm飞秒激光脉冲，并耦合入所述光子晶体棒；所述第二透镜和所述反射镜设置于所述光子晶体棒和所述长波通滤光片之间，所述第二透镜用于准直所述光子晶体棒产生的1665nm孤子脉冲，所述反射镜用于将准直后的1665nm孤子脉冲反射入所述长波通滤光片。

本发明与现有技术相比，有益效果在于：本发明提供了一种密封重水方法及检测多光子成像中多光子信号强度的方法，在装有待测样品的玻片上滴重水，并用石蜡油覆盖在所述重水上，利用多光子成像系统中产生的激发光照射到待测样品上，从而产生多光子信号，利用探测器收集所述多光子信号，并基于收集到的所述多光子信号检测所述多光子信号强度；通过判断所述多光子信号强度的变化是否在阈值范围内，来判断石蜡油密封重水的效果；本发明提供的检测多光子成像中多光子信号强度的方法，因为石蜡油对重水有很好的密封效果，重水在检测过程中没有吸收水蒸汽，从而使产生的多光子信号强度没有随着时间的增加而发生衰减；另外，也有利于基于荧光强度探测的时间动力学测量。

附图说明

图1是本发明实施例提供的固定有橡胶环的玻片的示意图；

图2是本发明实施例提供的一种检测多光子成像中多光子信号强度的方法；

图3是本发明实施例提供的多光子成像系统中的硬件结构示意图；

图4是本发明实施例提供的随时间衰减的sr101三光子荧光信号(左列)和小鼠脑部白质的三次谐波信号(右列)的示意图；；

图5是本发明实施例提供的没有密封重水的三光子荧光信号(红圈)和三次谐波信号(绿色方块)随时间衰减的变化曲线；

图6是本发明实施例提供的随时间衰减的荧光染料sr101三光子荧光信号(左列)和小鼠脑部白质的三次谐波信号(右列)的示意图；

图7是本发明实施例提供的归一化后的三光子荧光信号随时间变化的关系。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明采用了一种简单并且非常有效的方法将重水与水蒸汽隔绝，即用石蜡油将重水密封。石蜡油具有很好的疏水性，常被用来作为各种器件甚至包括食物在内的密封介质。我们通过三光子荧光成像和三次谐波成像检验了该技术，实验结果表明：经过5个小时，三光子荧光信号和三次谐波信号强度都没有产生衰减，从而可以证明用石蜡油对重水有很好的密封效果。

下面介绍本发明提供的一种密封重水方法，在重水表面滴石蜡油，使其覆盖在所述重水表面。

具体地，在密封重水时，我们将石蜡油迅速加到重水上以隔绝周围环境。石蜡油的浓度为0.85g/ml，比重水的浓度(1.11g/ml)小，这意味着石蜡油能够覆盖在重水的上面。石蜡油的疏水性和低密度使它成为将重水与周围环境隔绝开的最好选择。整个加入重水和石蜡油的过程最好在较短的时间内完成。

具体地，本发明实施例所用的石蜡油的用量和重水的用量相等。

下面再介绍本发明提供的一种检测多光子成像中多光子信号强度的方法，如图2所示，所述方法包括：

步骤s1，在装有待测样品的玻片上滴重水，所述装有待测样品的玻片置于多光子成像系统中；

具体地，如图1所示，所述待测样品(图1所用的待测样品为荧光染料)装在载玻片的左右两侧，并用盖玻片盖住，在左侧盖玻片上用牙科水泥固定一个橡胶环，所述重水滴在所述橡胶环的环内，以便于把所述重水圈在所述橡胶环内，防止所述重水扩散，从而更好的利用石蜡油密封重水；所述橡胶环的外径为22mm，内径为15.8mm，厚度为3.1mm。

具体地，如图3所示，所述多光子成像系统沿光路方向包括：飞秒激光器1、第一透镜2、光子晶体棒3、第二透镜4、反射镜5、带通滤光片6、多光子显微镜7，所述待测样品8置于所述多光子显微镜下。

具体地，所述飞秒激光器1(flcpa-02cszu,calmar)用于产生1550nm波长的飞秒激光脉冲，所述第一透镜2用于聚焦所述飞秒激光器1产生的1550nm飞秒激光脉冲，并耦合入所述光子晶体棒3(sc-1500/100-si-rod,nktphotonics)，通过孤子自频移效应在光子晶体棒3中产生1665nm孤子脉冲，作为孤子光源；所述第二透镜4用于准直所述光子晶体棒3产生的1665nm孤子脉冲，所述反射镜5用于将准直后的1665nm孤子脉冲反射入所述带通滤光片6；所述带通滤光片6用于去除残留的1550nm脉冲，保证只有1665nm的孤子脉冲作为激发光进入多光子显微镜7；所述多光子显微镜7用于使所述激发光照射到所述待测样品8上，并对所述待测样品8进行成像。

具体地，所述多光子显微镜7沿光路方向包括：扫描振镜71、扫描透镜72、套筒透镜73以及水浸物镜74；所述水浸物镜74为一个工作距离为2mm的水浸物镜(xlpln25xwmp2,olympus)。

步骤s2，滴石蜡油在所述重水上，使其覆盖在所述重水表面；

步骤s3，所述多光子成像系统中产生的激发光照射到待测样品上，产生多光子信号，利用所述多光子成像系统中的带通滤光片滤除特定波长的光信号，使所述待测样品产生的多光子信号透过，并利用所述多光子成像系统中的探测器收集所述多光子信号；

具体地，所述待测样品8为荧光染料(sulforhodamine101，sr101)，所述多光子信号为三光子荧光信号；所述带通滤光片6为第一带通滤光片(630/92)，用于滤除特定波长的光信号，使所述荧光染料产生的三光子荧光信号透过；所述探测器为镓砷磷探测器(h7422p-40,hamamatsu)，用于收集所述三光子荧光信号。

具体地，所述待测样品8为小鼠脑部白质，所述多光子信号为三次谐波信号；所述带通滤光片6为第二带通滤光片(558/20)，用于滤除特定波长的光信号，使所述小鼠脑部白质产生的三次谐波信号透过；所述探测器为砷化镓探测器，用于收集所述三次谐波信号。

步骤s4，基于收集到的所述多光子信号检测所述多光子信号强度，并判断所述多光子信号强度的变化是否在阈值范围内。

具体地，所述三光子荧光信号和所述三次谐波信号的采集和处理分别使用了软件scanimage(vidriotechnologies)和imagej(nih)。

具体地，所述阈值范围为一个较小的数值范围，若所述多光子信号强度的变化在该阈值范围内，则可认为检测过程中，多光子信号强度几乎没有发生变化，即代表用石蜡油对重水有很好的密封效果。

下面分别举在多光子成像时，重水密封和不密封条件下多光子信号强度随时间增加是否发生变化的实施例，来进一步论证石蜡油对重水的密封效果。

我们通过将重水密封和将重水暴露在外部环境中两种方式对同种样品进行了实验对比，在每种方式下，样品分别采用了荧光染料(sr101)和小鼠脑部白质，实验结果如下：

首先，成像过程中，我们在物镜前浸润了0.4ml未经密封的重水，在没有密封重水的情况下阐明三光子信号强度随时间衰减问题。在物镜前的激光功率保持一定时，sr101的三光子荧光信号(图4，左列)和小鼠脑部切片的三次谐波信号(图4，右列)的强度会由于重水吸收水而随时间衰减，图4中的两种信号都进行归一化处理，最大值均为65535。标尺：50μm。当然，这有可能是光漂白所导致的(尤其是对sr101)。为了排除这个可能性，我们将已经吸收过空气中水蒸汽的重水完全清除并替换上新的重水，再次观察多光子信号，发现此时的信号强度回到了初始值。成像期间，我们始终用scanimage控制快门使得在采集三光子荧光信号和三次谐波信号时才有激光照射到样品上，避免光漂白现象。

其次，为了定量分析重水吸收水蒸汽的速度，我们测量了多光子信号强度随时间变化的关系，如图5所示。尽管成像所使用的样品以及成像方式并不相同，三光子荧光信号(图5中的圈圈)和三次谐波信号(图5中的方块)都展现了相同的衰减特性，图中的两种信号进行了归一化处理，最大值均为65535。标尺：50μm。35分钟后，三光子荧光信号和三次谐波信号强度都降低为它们各自的初始值的一半(t＝0)，随着时间的增加，信号强度变得更弱，一个小时后，三光子荧光信号和三次谐波信号强度降低了约65％。

接下来，我们采用密封重水的方法进行三光子成像和三次谐波成像，在密封重水时，我们首先用牙科水泥将一个橡胶环(外径22毫米，内径15.8毫米，厚度3.1毫米)固定在玻片上，如图1。橡胶环15.8毫米的内径保证了物镜在大范围移动的时候不会撞到橡胶环，对观察生物组织十分有利，比如观察小鼠脑部白质的三次谐波信号。成像过程中，我们在物镜前浸润0.4ml经过密封的重水，在密封重水时，我们将0.4ml的石蜡油迅速加到重水上以隔绝周围环境。石蜡油的浓度为0.85g/ml，比重水的浓度(1.11g/ml)小，这意味着石蜡油能够覆盖在重水的上面，石蜡油的疏水性和低密度使它成为将重水与周围环境隔绝开的最好选择，整个加入重水和石蜡油的过程可以在30秒内完成。实验过程中，室内温度和相对湿度分别在19.8～20.1℃和47～51％的范围内。这次成像时间为5小时，如图6所示。与未密封重水时相比，三光子荧光信号(图6，左列)和三次谐波信号(图6，右列)都没有观察到衰减，图中的两种信号都进行归一化处理，最大值均为65535。标尺：50μm；这证明了信号强度的衰减不是由于光漂白导致，而是由于重水吸收水后透过率下降导致的，同时证明了石蜡油密封重水的有效性。

最后，我们分析了密封重水后荧光染料sr101的三光子荧光信号随时间变化的关系，如图7所示，采样间隔为10分钟，三光子荧光信号经归一化处理，并且信号归一化的平均值为1，信号平均强度的最大波动为6.4％，均方根值的起伏为1.75％，这个抖动是由孤子激光光源的功率抖动所导致的。从图中可以看到，重水被石蜡油很好的密封，与周围环境隔绝。在5小时的实验过程中，重水对激发光的透过率没有产生明显的衰减。尽管测量时间为5小时，但这对更长时间的实验过程依然适用，原因为：(1)，由于石蜡油的疏水性，水蒸汽不会被重水吸收；(2)，同时，重水也不会穿透石蜡油挥发到周围环境中。

本发明提出了一种隔绝重水与周围环境的方法，即用石蜡油密封重水；并在1700nm波段探测荧光染料三光子荧光信号和生物组织三次谐波信号的实验中展示了这种技术，在长达5个小时的成像过程中，被密封的浸润介质没有受到周围环境中水蒸汽的影响，所探测的三光子荧光信号和三次谐波信号强度均保持不变，说明石蜡油对重水有很好的密封性。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。