一种免疫检测仪及其试剂在手术中的新用途及使用方法与流程

本发明涉及医疗领域，特别是一种免疫检测仪及其试剂在手术中的新用途及使用方法

背景技术：

申请号为201610851934.5，授权公告号为cn106370836a，一种免疫检测仪及其使用方法公开了一种免疫检测仪，其在实际生产中型号为佰奥达免疫检测仪，用于对人体的血清、血浆、全血的检测标志物(其中包含甲状旁腺素)进行定量检测分析，为临床提供辅助诊断，但是在临床应用中，我们发现免疫检测仪联合甲状旁腺素检测试剂可在甲状腺手术中定量测定从组织中提取的组织洗脱液的甲状旁腺素含量，其测定结果快速、准确。而分泌甲状旁腺素是甲状旁腺独有的生理功能，其腺体内的甲状旁腺激素含量远高于其他组织，因此这一免疫检测仪及其试剂盒可用于甲状旁腺的识别，从而为保护甲状旁腺创造条件。

甲状腺癌是全球范围发病率上升最快的实体恶性肿瘤，甲状腺全切除及中央区淋巴结清扫已成为甲状腺癌常用的手术治疗方式，但是甲状旁腺损伤导致的术后甲状旁腺功能低下仍是困扰甲状腺外科医师的难题，甲状旁腺损伤主要包括挫伤、血供障碍和误切。甲状腺术后暂时性和永久性甲状旁腺功能低下的发生率分别为14％-60％和4％-11％，暂时性甲状旁腺功能低下会造成一过性低钙症状，但对病人生活质量不会造成大的影响；而永久性甲状旁腺功能低下则会造成永久性的低钙症状，多以手足麻木和四肢抽搐为表现，严重影响病人的生活质量，并成为产生医疗纠纷的主要因素。因此，应重视甲状腺手术中甲状旁腺的保护，避免手术时误切误伤甲状旁腺。

但是甲状旁腺为内分泌腺，多数为扁椭圆形小体，活体呈棕黄色，犹如米粒或似压扁的黄豆，直径约3～6mm，外有薄层的结缔组织膜包裹。甲状旁腺的数目不定，文献报道约48％～62％中国人具有4枚，但也可出现少于4枚或多达十余个的变异，并且变异的甲状旁腺其形状大小及颜色均有变异，形状会因病变而呈片状、线状、条索状，大小也会因病变而萎缩或增生，色泽因被脂肪包覆而显脂肪色。这增加了识别的难度。而识别甲状旁腺的传统方法主要有肉眼识别法、比重法、冰冻切片病理检查法、亚甲蓝正显影法、纳米碳负显影法，但是肉眼识别法较为主观，误差较大；而比重法不能原位识别，需离体测定，且旁腺被脂肪包裹时，也将浮于水面，很可能被当作脂肪球而误切；冰冻切片病理检查则操作复杂，鉴定时间较长(大于30分钟)需要术者在手术中等待结果，再做下一步操作，延宕手术时间；亚甲蓝正显影法虽较为直观，但是作为一种药物，超适应症用药，副作用大，且无法识别变异的甲状旁腺；纳米碳负显影法准确率虽较高，但是也常常无法区分脂肪和旁腺，当淋巴管阻塞时，很可能误导术者的判断，错保留已有癌细胞转移的淋巴结，后果严重，且费用较高。因此甲状旁腺的快速、准确、经济的识别方法具有实际临床意义。

技术实现要素：

本发明所要解决的一个技术问题是提供申请号为201610851934.5，授权公告号为cn106370836a，发明名称为一种免疫检测仪及其使用方法所公开的一种免疫检测仪，实际生产中型号为佰奥达免疫检测仪的新用途。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供这种新用途的操作方法及其提供这种新用途的操作方法中涉及的甲状旁腺素检测试剂盒。

本发明达到的技术效果是:

①准确，专一性高，检测“组织洗脱液”中甲状旁腺激素的浓度，显著区分周围的淋巴结，脂肪等。

②抗干扰，分泌甲状旁腺素是甲状旁腺独具的生理功能，因此手术部位组织和器官的复杂病生理背景不影响测定结果。

③快速，12分钟内可以做出判断，不延宕手术时间。

④操作简单、判断直观，操作步骤1—2人即可完成，直接给出甲状旁腺激素的浓度数值做判断。

⑤经济，成本费用较低，不增加患者负担。

⑥多点识别，可以同时对手术中多个部位进行识别。

本发明解决上述技术问题采取的技术方案是：申请号为201610851934.5，授权公告号为cn106370836a，发明名称为一种免疫检测仪及其使用方法所公开的一种免疫检测仪的新用途，用于甲状旁腺的识别。

进一步的，其在甲状旁腺的识别上的用途是通过对疑似甲状旁腺组织提取出的组织洗脱液进行检测达到识别目的的。

本发明人经广泛研究试验发现，申请号为201610851934.5，授权公告号为cn106370836a，一种免疫检测仪及其使用方法所公开的一种免疫检测仪用于甲状旁腺的识别上能够有快速准确的结果。

其用于新用途的具体使用方法是：

为解决上述技术问题，本发明是按如下方式实现的：

步骤1.开机，选择检测模式，待检。

步骤2.提取疑似甲状旁腺的组织洗脱液。

步骤3.使用移液器吸取步骤2中提取的组织洗脱液90μl，加入甲状旁腺素检测试剂盒的进样区。

步骤4.将步骤3中加入了组织洗脱液的甲状旁腺素检测试剂盒插入免疫检测仪的检测端口进行检测。

进一步的，步骤2中所述的疑似甲状旁腺仍在原位时，其组织洗脱液的提取步骤为：术者术中定位疑似甲状旁腺，用有齿眼科镊夹破其被膜，眼科镊尖端蘸取渗出的组织液，同时手术护士用1ml注射器抽取1ml生理盐水，注射到无菌小瓶中；术者将蘸取了组织液的眼科镊在无菌小瓶中濯洗，将镊子上粘附的组织液洗脱，术者重复此操作濯洗3次，得组织洗脱液。

进一步的，步骤2中所述的疑似甲状旁腺仍在原位时，其组织洗脱液的提取步骤还可以为：由手术护士用1ml注射器抽取1ml生理盐水，注射至无菌小瓶中，同时注射器中保留少量生理盐水，再将此注射器穿刺入疑似甲状旁腺组织内，利用负压抽吸少量组织液后退针，然后将针尖浸入无菌小瓶的生理盐水中反复抽取与注回2-3次，以充分清洗针筒，随后将液体全部注射至无菌小瓶中，组织洗脱液即制作完毕。这一组织洗脱液的制作方法我们将之命名为针吸法。

进一步的，步骤2中所述的疑似甲状旁腺已被误切或虽在原位但观察已无血供时，其组织洗脱液的提取步骤为：术者可将其取出，成为离体的疑似甲状旁腺；将其放置于弯盘一角，用手术刀切成多个部分，手术护士用1ml注射器抽取1ml生理盐水滴淋其上，术者将之混匀再用注射器回抽，注射到无菌小瓶中，组织洗脱液即制作完毕。

进一步的，在将离体的疑似甲状旁腺切成多个部分时，应切成片状，这样方便在检测结果为甲状旁腺后直接植回做补救。

进一步的，步骤1中的检测模式为常规检测模式或快速检测模式中的一种。

进一步的，步骤1中选择了常规检测模式时，步骤4中将甲状旁腺素检测试剂盒插入免疫检测仪的检测端口进行检测的步骤为：输入患者信息，将甲状旁腺素检测试剂盒插入免疫检测仪的进样口，仪器自动计时，时长12分钟；12分钟后仪器自动读数；根据这一取样方法取样，根据研究，此法所得数据大于65pg/ml，即可确认该组织为甲状旁腺。

进一步的，步骤1中选择了快速模式时，步骤4中将甲状旁腺素检测试纸插入免疫检测仪的检测端口进行检测的步骤为：将甲状旁腺素检测试剂盒取出并静置12分钟后，将甲状旁腺素检测试剂盒插入免疫检测仪的检测口，输入患者信息后即读数；所得读数大于65pg/ml，即可判断为阳性；快速检测模式适用于多个组织或部位需要识别与鉴定的情况。

进一步的，步骤3中所述的甲状旁腺素检测试剂盒，包括塑料卡盒与装在盒里的甲状旁腺素检测试纸，塑料卡盒设置有加样孔，甲状旁腺素检测试纸包括底板、样品垫、化学偶合垫、反应垫和吸水垫，底板设置为长条形，样品垫、化学偶合垫、反应垫和吸水垫依次搭接固定覆盖在底板上方；样品垫用于接受样品，样品垫设置在塑料卡盒的加样孔下方，步骤2中所得到的组织洗脱液通过加样孔滴入样品垫；化学偶合垫上包被有金标抗体偶合物，样品垫上的组织洗脱液在毛细管作用下前行至化学偶合垫与金标抗体偶合物结合成免疫复合物；反应垫包括检测区和质控区，检测区预先包被有甲状旁腺素第一抗体，在质控区包被有羊抗链霉亲和素抗体，免疫复合物继续前行到反应垫的检测区与甲状旁腺素第一抗体特异性结合而被截留形成检测线，未反应完全的免疫复合物继续前行到反应垫的质控区与羊抗链霉亲和素抗体特异性结合形成质控线。

进一步的，所述底板设置为pvc材质，所述样品垫设置为无纺布或玻璃纤维膜，所述化学偶合垫设置为玻璃纤维膜或聚酯膜，所述反应垫设置为硝酸纤维素膜，所述吸水垫设置为吸水滤纸，所述金标抗体偶合物属于胶体金标记的甲状旁腺素第二抗体和胶体金标记的链霉亲和素的偶合物。

本发明所公开的甲状旁腺素检测试剂盒采用固相免疫层析分析技术，利用双抗体夹心法原理，在检测试纸条硝酸纤维素膜上的检测区预先包被有甲状旁腺素第一抗体，在质控区包被有羊抗链霉亲和素抗体，在检测试纸条的化学偶合垫上包被有胶体金标记的甲状旁腺素第二抗体和胶体金标记的链霉亲和素的偶合物。检测时，首先将组织洗脱液加到加样孔中，组织洗脱液中的待检物甲状旁腺素多肽链的中段(53-68)与化学偶合垫上事先包被的金标抗体偶合物结合形成免疫复合物，该免疫复合物随着膜的毛细管作用层析至检测区，与已预先包被在检测区的甲状旁腺素第一抗体发生特异性结合(c端结合)而被截留，聚集而形成检测线，未反应的免疫复合物继续层析至质控区，与预先包被在膜上的羊抗链霉亲和素抗体特异性结合，形成质控线。在一定范围内，检测线颜色的深浅与待检样品中的甲状旁腺素含量呈正比例关系。反应完成后，通过免疫检测仪对检测线和质控线进行扫描分析，并按照仪器内部预置的参数进行计算，从而定量检测组织洗脱液中的甲状旁腺激素含量。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合具体实施方式和附图，对本发明做进一步详细说明。在此，本发明的示意性实施方式及其说明用于解释本发明，但并不作为对本发明的限定。

附图说明：

图1，甲状旁腺素检测的原理示意图。

图2，甲状旁腺素检测试纸的结构示意图。

1、底板；2、样品垫；3、化学偶合垫；4、反应垫；5、吸水垫；6、检测线；7、质控线。

1、甲状旁腺素检测试剂盒的实施例：包括塑料卡盒与装在盒里的甲状旁腺素检测试纸，塑料卡盒设置有加样孔，且塑料卡盒设置有能够观察到试纸的透视窗，甲状旁腺素检测试纸包括底板、样品垫、化学偶合垫、反应垫和吸水垫，底板设置为长条形，样品垫、化学偶合垫、反应垫和吸水垫依次搭接固定覆盖在底板上方；样品垫用于接受样品，样品垫设置在塑料卡盒的加样孔下方，步骤2中所得到的组织洗脱液通过加样孔滴入样品垫；化学偶合垫上包被有金标抗体偶合物，样品垫上的组织洗脱液前行至化学偶合垫与金标抗体偶合物结合成免疫复合物；反应垫包括检测区和质控区，检测区预先包被有甲状旁腺素第一抗体，在质控区包被有羊抗链霉亲和素抗体，免疫复合物继续前行到反应垫的检测区与甲状旁腺素第一抗体特异性结合而被截留形成检测线，未反应完全的免疫复合物继续前行到反应垫的质控区与羊抗链霉亲和素抗体特异性结合得到质控线。

进一步的，所述底板设置为pvc材质，所述样品垫设置为无纺布或玻璃纤维膜，所述化学偶合垫设置为玻璃纤维膜或聚酯膜，所述反应垫设置为硝酸纤维素膜，所述吸水垫设置为吸水滤纸，所述金标抗体偶合物具体为胶体金标记的甲状旁腺素第二抗体和胶体金标记的链霉亲和素的偶合物。

本发明所公开的甲状旁腺素检测试剂盒采用固相免疫层析分析技术，利用双抗体夹心法原理，在检测试纸条硝酸纤维素膜上的检测区预先包被有甲状旁腺素第一抗体，在质控区包被有羊抗链霉亲和素抗体，在检测试纸条的化学偶合垫上包被有胶体金标记的甲状旁腺素第二抗体和胶体金标记的链霉亲和素的偶合物。检测时，首先将组织洗脱液加到加样孔中，组织洗脱液中的待检物甲状旁腺素多肽链的中段(53-68)与化学偶合垫上事先包被的金标抗体偶合物结合形成免疫复合物，该免疫复合物随着膜的毛细管作用层析至检测区，与已预先包被在检测区的甲状旁腺素第一抗体发生特异性结合(c端结合)而被截留，聚集而形成检测线，未反应的免疫复合物继续层析至质控区，与预先包被在膜上的羊抗链霉亲和素抗体特异性结合，形成质控线。在一定范围内，检测线颜色的深浅与待检样品中的甲状旁腺素的含量呈正比例关系。反应完成后，通过免疫检测仪对检测线和质控线进行扫描分析，并按照仪器内部预置的参数进行计算，从而定量检测组织洗脱液中的甲状旁腺激素含量。

甲状旁腺素检测试剂盒使用了免疫胶体金技术，是以胶体金作为示踪标志物标记抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金(colloidalgold)也称金溶胶，是由金盐被还原成金后形成的金颗粒悬液。胶体金颗粒由一个基础金核(原子金au)及包围在外的双离子层构成，接近于金核表面的是内层负离子(auc12－)，外层离子层h+则分散在胶体间溶液中，颗粒间的静电排斥力使胶体金游离于溶胶之间，形成悬液。胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。胶体金颗粒对蛋白质有很强的吸附功能，而不被坏其生物活性，可以与蛋白质等(葡萄球菌a蛋白、免疫球蛋白)等非共价结合，形成胶体金标记物。体外快速诊断试剂所采用的示踪材料主要是胶体金纳米颗粒，而胶体金颗粒的大小以及分散性是否均一对试剂产品的检测灵敏性和精密性产生非常大的影响。传统的胶体金颗粒制备方法获得的胶体金颗粒颜色往往呈现为紫红色，大小主要在20-40nm左右，分散性不均匀，从而导致试剂产品的检测灵敏度偏低，精密性以及批间差比较大。而在这一新用途中涉及的甲状旁腺(甲状旁腺素)检测试剂其颗粒大小为100nm左右，而且具有良好的分散性和均一性，采用该大颗粒胶体金对抗体进行偶合，可大大提高产品的检测灵敏性以及精密性。

2、免疫检测仪用于甲状旁腺识别的使用方法的常规检测模式的实施例：

步骤1.开机待检

将佰奥达免疫检测仪开机，用触控笔点选常规检测模式，待检。

步骤2.组织洗脱液的制作

夹取法：疑似甲状旁腺在原位时，组织洗脱液的获取与制作：术者术中定位疑似甲状旁腺，用有齿眼科镊夹破其被膜，眼科镊尖端蘸取渗出的组织液，同时手术护士用1ml注射器抽取1ml生理盐水，注射到无菌小瓶中。术者将蘸取了组织液的眼科镊在无菌小瓶中濯洗，将镊子上粘附的组织液洗脱，术者重复此操作濯洗3次，得组织洗脱液。

针吸法：由手术护士用1ml注射器抽取1ml生理盐水，注射至无菌小瓶中，同时注射器中保留少量生理盐水，再将此注射器穿刺入疑似甲状旁腺组织内，利用负压抽吸少量组织液后退针，然后将针尖浸入无菌小瓶的生理盐水中反复抽取与注回2-3次，以充分清洗针筒，随后将液体全部注射至无菌小瓶中，组织洗脱液即制作完毕。这一组织洗脱液的制作方法我们将之命名为针吸法。

混悬液法：若疑似甲状旁腺已被误切或虽在原位但观察已无血供，术者可将其取出，成为离体的疑似甲状旁腺。将其放置于弯盘一角，用手术刀切成多个部分，手术护士用1ml注射器抽取1ml生理盐水滴淋其上，术者将之混匀再用注射器回抽，注射到无菌小瓶中，组织洗脱液即制作完毕。说明：在将疑似旁腺组织切成多个部分时，最好切成片状，检测结果为甲状旁腺后直接植回做补救。

步骤3.取样、进样打开甲状旁腺检测试剂盒包装，取出试剂盒移液枪接好枪头，使用移液器取上述组织洗脱液90μl，将组织洗脱液从进样孔加入甲状旁腺检测试剂盒。

步骤4.检测

将甲状旁腺检测试纸插入仪器的检测端口，输入患者信息，仪器自动计时，时长12分钟。12分钟后仪器自动读数。根据我们临床试验的数据，最后检得结果与冰冻切片病理结果做验证，此法所得数据大于65pg/ml，时，冰冻切片病理结果为甲状旁腺。

3、免疫检测仪用于甲状旁腺识别的使用方法的快速检测模式的实施例：

步骤1.开机待检

将佰奥达免疫检测仪开机，用触控笔点选快速检测模式，待检。

步骤2.组织洗脱液的制作

夹取法：术者术中定位疑似甲状旁腺，用有齿眼科镊夹破其被膜，眼科镊尖端蘸取渗出的组织液，同时手术护士用1ml注射器抽取1ml生理盐水，注射到无菌小瓶中。术者将蘸取了组织液的眼科镊在无菌小瓶中濯洗，将镊子上粘附的组织液洗脱，术者重复此操作濯洗3次，得组织洗脱液，这一组织洗脱液的制作方法我们将其命名为夹取法。

针吸法：由手术护士用1ml注射器抽取1ml生理盐水，注射到无菌小瓶中。术者用同一个注射器，吸取生理盐水少许，再将此注射器穿刺入疑似甲状旁腺组织内，利用负压抽吸少量组织液，注射器退出体外，然后将针尖浸入装有生理盐水的无菌小瓶中反复抽取、注回生理2-3次，充分清洗针筒后将液体全部注射至无菌小瓶中，组织洗脱液即制作完毕。

混悬液法：若疑似甲状旁腺已被误切或虽在原位但观察已无血供，术者可将其取出，成为离体的疑似甲状旁腺。将其放置于无菌弯盘一角，用手术刀切成多个部分，手术护士用1ml注射器抽取1ml生理盐水滴淋其上，术者将之混匀再用注射器回抽，注射入无菌小瓶中，组织洗脱液即制作完毕。说明：在将疑似旁腺组织切成多个部分时，最好切成片状，确认阳性后直接植回做补救。

步骤3.使用移液器取上述组织洗脱液90μl，从甲状旁腺素检测试剂盒的进样孔滴到甲状旁腺素检测试纸，旁置，孵育时间3分钟-12分钟。

步骤4.快速检测

将甲状旁腺素检测试纸插入检测口，输入患者信息后即读数。最后检得结果与冰冻切片病理结果做验证，此法所得数据大于65pg/ml，均为阳性(即确认是甲状旁腺)。快速检测模式适用于多个检测部位需要检测或只需初略判断的情况。

使用免疫检测仪对甲状旁腺进行识别，可以在十二分钟内完成检测，且使用快速检测模式，可以同时对多个检测部位检测，并且操作简单方便，成本较低，其原理是对组织洗脱液中甲状旁腺激素浓度进行检测，根据浓度结果直观判断疑似组织是否为甲状旁腺，结果较为准确。