检测经硫磺熏蒸的土茯苓及其制品的方法与流程

本发明涉及中药检测领域。更具体地说，本发明涉及一种检测经硫磺熏蒸的土茯苓及其制品的方法。

背景技术：

土茯苓为百合科菝葜属植物光叶菝葜的干燥根茎，是药食两用资源，归肝、胃经，具有除湿、解毒、通利关节等功效。现代研究表明土获苳具有广泛的药理活性，主要表现在心血管药理作用、抗肿瘤、抗炎、免疫调节、抗氧化、抑菌、降尿酸、保护肾功能等方面，临床上主要用于治疗微生物感染、泌尿生殖系统、结缔组织系统、皮肤病、消化系统等方面的疾病。民间常用土茯苓食补或作为保健品，尤其在中国南方，还普遍作为汤料用于煲汤。此外，土茯苓还是龟苓膏的重要原材料，龟苓膏作为一种传统特色功能食品，受到中国、日本、韩国、新加坡等东南亚国家普遍欢迎。

研究表明，土茯苓中主要含有黄酮类、二苯乙烯、苯丙素类等成分，并表现出多种生物活性，如落新妇苷具有利尿、镇痛、抗炎，免疫抑制、抗肿瘤等活性,主要黄烷醇类成分，表儿茶素具有抗氧化、调节血脂水平、抗肿瘤等活性，5-o-咖啡酰基莽草酸及黄杞苷均有抗肿瘤、抗氧化作用。

随着土茯苓用量和贮存量的增加，民间种植散户沿用传统硫磺熏蒸养护的现象仍较普遍。适量的硫磺熏蒸可以达到防虫防霉的目的，但一些药农和经销商为了追求经济利益，用工业硫磺长期反复熏蒸已经严重影响了药材的质量。现代研究证明硫磺熏蒸前后中药材及饮片的性状多有改变，并且会使其中残留大量的二氧化硫及砷、汞等重金属，对人体具有多种危害；由于二氧化硫是一种强还原剂，可能与中药材中含有羰基，羧基的成分发生化学反应，导致有效成分的损失，因此可能改变药物的性味，降低药物疗效，从而直接影响中药饮片的品质。2012年，广州查获一批“毒土茯苓”，黑工厂将经有毒硫磺熏制得到的“毒土茯苓”大量流入市场，作为汤料进入人们的日常生活中。据报道，食用硫磺熏蒸过的中药材、食物等会对消化道和呼吸系统粘膜造成损害，导致呕吐、腹泻、恶心等症状，严重的甚至会危害人的肝脏、肾脏。有些劣质硫磺的铅、汞等重金属含量超标，长期食用会引起慢性中毒。

如何正确认识和处理硫磺熏蒸问题，关系中药材品质安全，因此，亟待建立快速、有效的检测硫磺熏蒸土茯苓及其制品的方法。

前期研究表明，硫磺熏蒸能够导致土茯苓中主要活性成分的含量降低。2015版《中国药典》收载的土茯苓的品质评价标准主要包括性状、鉴别、检查、含量测定等几个方面，其中落新妇苷不得少于0.45％。目前已有的报道中尚无关于硫磺熏蒸后土茯苓化学成分的变化的研究，对硫磺熏蒸土茯苓药材的快速检测方法尚未见报道。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供一种样品处理方法简便、分析时间缩短和特异性强的鉴定硫磺熏蒸土茯苓药材的方法。

为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种检测经硫磺熏蒸的土茯苓或其制品的方法，包括以下步骤：

步骤一、制备经硫磺熏蒸的土茯苓或其制品的样品溶液a和未经硫磺熏蒸的土茯苓或其制品的样品溶液b；

步骤二、采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱联用的方法分别对样品溶液a和样品溶液b进行质谱数据采集，其中选用的碰撞电压为35～50v；

步骤三、将样品溶液a和样品溶液b的原始质谱数据进行预处理，对比确定样品溶液a相比于样品溶液b中出现的差异成分的质谱数据即为标志性硫化产物或其碎片的质谱数据；

步骤四、制备未知的土茯苓或其制品的样品溶液c，并使用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱联用的方法采集质谱数据，对比标志性硫化产物或其碎片的质谱数据即可知土茯苓是否被熏蒸。

优选的是，步骤一中，样品溶液a和样品溶液b的制备方法具体为：取经硫磺熏蒸的土茯苓或其制品和未经硫磺熏蒸的土茯苓样品或其制品分别制成粉末，再使用体积分数为80％甲醇分别配置成溶液，使用超声波提取30min，冷却后继续加入相同体积分数的甲醇定容为10mg/ml的，然后摇匀过滤，取续滤液即得样品溶液a和样品溶液b。

优选的是，步骤二中进行超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱联用时，采取梯度洗脱的方式。

优选的是，步骤二中梯度洗脱的a相为体积分数为0.1％的甲酸溶液，b相为乙腈。

优选的是，乙腈的比例变化为：5–10％b(0–1.0min)；10–12％b(1–2.5min)；12–25％b(2.5–7.0min)；25-35％b(7.0–7.5min)；35–48％b(7.5–11.5min)；48–70％b(11.5–12.0min)；70–90％b(12.0–13.0min)；90–5％b(13.0–13.1min)；5％b(13.1–15.0min)。

优选的是，步骤二中进行超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱联用时，采用负离子ms^e采集模式。

优选的是，步骤三中进行计算分析的参数设定为：保留时间范围为1-10min，质谱范围为m/z100-1000，质量允许偏差设定为0.01da，噪音消除水平为6.00，强度阈值设为100，质谱窗口设为0.02da。

优选的是，步骤三中对样品溶液a和样品溶液b中出现的差异成分的质谱数据的分析方法为主成分分析法和正交偏最小二乘法，其中选取变量权重值vip>1的质谱数据为标志性硫化产物或其碎片的质谱数据。

优选的是，步骤一后步骤二前还包括以下步骤：将样品溶液a和样品溶液b中分别加入含有1.0×10^-4mol/l邻苯二酚的pbs缓冲溶液，选用的pbs缓冲溶液的ph值均为7.4，磷酸根浓度均为0.1mol/l，并采用以玻碳电极为工作电极的三电极体系分别对加入了pbs缓冲溶液的样品溶液a和样品溶液b进行循环伏安法扫描，扫描的参数设置为：初始电位-0.4v、最高电位1v、最低点位-0.4v、最终电位-0.4v、扫描速率0.05v/s、扫描次数2次、灵敏度10^-4a/v、等待时间为2s。

本发明至少包括以下有益效果：

1、首次实现了硫磺熏蒸土茯苓及其制品的快速检测。

2、采用二级质谱，找到各种标志成分的特征离子碎片，可以同时对组分进行鉴定。

3、本发明选用的碰撞电压是35-50v，此时各组特征离子峰可以检测到且形成的碎片离子峰面积最大，若碰撞电压过低，离子峰不足以破碎，形成的碎片离子丰度低；若碰撞电压过高，特征离子峰也随之破碎，无法鉴别。

4、选用80％甲醇作为提取溶剂，采用超声提取方法，超声30min。对目标成分提取效果好，且方法简单已操作。

5、采用梯度洗脱，辅以本发明提供的乙腈比例变化数据，能最大程度分离溶液中各种成分，检测结果更为准确。

6、采用主成分分析法和正交偏最小二乘法，辅以计算分析前的参数设定，不仅能较好的去处背景噪音，同时计算结果准确可靠，相比于人工对谱分析还大大节约了时间。

8、在进行液质联用分析前，对样品溶液进行三电极循环伏安法扫描，能快速分离溶液中的重金属离子，降低后续液质联用分析的背景噪音，使检测结果更为精确。

7、经验证，本发明提供的方法准确度高，可对市场中流通的土茯苓药材及其制品是否经过硫磺熏蒸的进行检测，以达到质量控制的目的。

本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。

附图说明

图1为实施例1中样品溶液a和样品溶液b的质谱图；

图2为实施例1中样品溶液a和样品溶液b的质谱数据pca分析scores得分图；

图3为实施例1中样品溶液a和样品溶液b的质谱数据opls-da分析s-plot图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

<实施例1>：

步骤一、取新鲜的土茯苓药材和经硫磺熏蒸的土茯苓药材分别切片晒干，然后研成粉末，各取0.5g分别置于50ml容量瓶中，加入80％甲醇20ml，使用超声提取20-30min后取出，冷却至室温，再分别加入80％甲醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液即为样品溶液a和样品溶液b。

步骤二、采用超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱联用的方法分别对样品溶液a和样品溶液b进行离子碎片质谱数据采集，其中色谱条件为：使用acquityuplchsst3色谱柱(2.1mm×100mm，1.8μm)；采用梯度洗脱的方式，流动相中a相为0.1％甲酸水溶液，b相为乙腈，其中乙腈的比例变化为：5–10％b(0–1.0min)；10–12％b(1–2.5min)；12–25％b(2.5–7.0min)；25-35％b(7.0–7.5min)；35–48％b(7.5–11.5min)；48–70％b(11.5–12.0min)；70–90％b(12.0–13.0min)；90–5％b(13.0–13.1min)；5％b(13.1–15.0min)，流动相的流速为0.5ml·min^-1，色谱柱的柱温维持35℃，进样量在2μl。

质谱条件为：esi^-离子化模式，毛细管电压2.8kv，锥孔电压40v，除溶剂温度350℃，除溶剂气体流速700l·h^-1，离子源温度300℃，采用ms^e数据采集方式，采集时间15min，扫描范围：m/z100～1500，扫描时间0.2s，碰撞能量：低能量4v，梯度高能量35～50v，碰撞气体：高纯氩气。

步骤三、如图1所示，将样品溶液a和样品溶液b的原始质谱数据进行峰识别、峰对齐、基线矫正和峰面积归一化法预处理，然后进行多元统计分析(pca、opls-da)。分析参数设定:保留时间范围为1-10min，质谱范围为m/z100-1000，质量允许偏差设定为0.01da，噪音消除水平为6.00，强度阈值设为100，质谱窗口设为0.02da。

本实施例中首先采用pca对硫磺熏蒸和未经硫磺熏蒸土茯苓进行主成分分析，通过r2x、r2y、q2参数评价pca模型质量，其中r2x、r2y越接近1表示模型越稳定，q2>0.5表示预测率高。本实验中pca模型包含7个主成分，其拟合参数为r2x＝0.735，r2y＝0.833，q2＝0.658，表明所构建的pca模型稳定性和预测率较高。如图2所示，硫磺熏蒸和未经硫磺熏蒸土茯苓分为两组，表明其化学成分存在明显差异。

为了找出差异标志物，采用了opls-da分析，进一步分析两组数据的整体差异性，利用变量权重值(vip>1)找到差异性标志物。如图3所示，在图中s型曲线上的每一个点代表1个化合物，靠近中间部分为对2组样品中差异贡献较小的成分，离原点越远，代表其对对2组样品差异贡献越大。总体而言，在s型曲线两端的数据点分别代表了样品中可信度最高的差异标志物，其出现时间和荷质比分别为：a(tr＝4.12min，m/z＝529.0650)；b(tr＝1.79min，m/z＝415.0333)；c(tr＝2.94min，m/z＝417.0491)；d(tr＝6.39min，m/z＝449.1020)；e(tr＝1.45min，m/z＝439.0545)；f(tr＝2.94min，m/z＝415.0338)；g(tr＝2.06min，m/z＝417.0489)；h(tr＝5.85min，m/z＝449.1091)；i(tr＝5.67min，m/z＝449.1098)；j(tr＝3.72min，m/z＝335.0770)，由于样品溶液a中包含硫磺熏蒸后的特征成分，故可以确定a～g为标志性硫化产物或者其碎片的质谱数据，对应于图1中2、6、9、14、15、21、26的峰位。

步骤四、从成都、广西横县、广州清平分别采购土茯苓样品，并均按照步骤一和步骤二中所述的方法采集质谱数据，再进行峰识别、峰对齐、基线矫正后与步骤三中得到的标志性硫化产物或者其碎片的质谱数据进行对比，结果见表1，6组实验中的土茯苓原料均为未经硫磺熏蒸的新鲜土茯苓，经过不同处理后两两对照检测，可以看出被熏蒸后的土茯苓的检出率为100％。

表1、本方法的检测准确度检验结果

另外，为了明确硫化产物的具体物质，添加对照组实验：精密称取表儿茶素、新落新妇苷、落新妇苷、新异落新妇苷、黄杞苷、异落新妇苷对照品适量，加入50％的甲醇分别制成含有表儿茶素、新落新妇苷、落新妇苷、新异落新妇苷、黄杞苷、异落新妇苷0.1mg/ml的溶液备用，再按步骤一和步骤二所述的方法分别对含有表儿茶素、新落新妇苷、落新妇苷、新异落新妇苷、黄杞苷、异落新妇苷的甲醇溶液采集质谱数据，由于现有技术已探明土茯苓中包含有黄酮类成分和黄烷类成分，如落新妇苷、表儿茶素、5-o-咖啡酰基莽草酸等，因此，只需在相应的数据库中查找对照组的质谱数据就可以大致明确相应基团，再将样品溶液a的质谱数据与对照组的相比，就可知道哪些基团发生了变异，再结合硫化过程，完全可推导出硫化产物的具体成分，如表2所示。

表2特征硫化产物的uplc-qtof-ms/ms精确分子量及碎片信息

<实施例2>：

在实施例1的基础上，步骤一后步骤二前加入以下步骤：将样品溶液a和样品溶液b中分别加入含有1.0×10^-4mol/l邻苯二酚的pbs缓冲溶液，选用的pbs缓冲溶液的ph值均为7.4，磷酸根浓度均为0.1mol/l，并采用以玻碳电极为工作电极的三电极体系分别对加入了pbs缓冲溶液的样品溶液a和样品溶液b进行循环伏安法扫描，扫描的参数设置为：初始电位-0.4v、最高电位1v、最低点位-0.4v、最终电位-0.4v、扫描速率0.05v/s、扫描次数2次、灵敏度10^-4a/v、等待时间为2s。

进过上述步骤后，进一步缩短了超高效液相色谱-四极杆-飞行时间质谱联用所需的时间，同时在快速分离样品溶液中的重金属离子后，也消除了部分影响分析的无效质谱数据。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。