透射式共焦CARS显微光谱测试方法及装置与流程

本发明属于显微光谱成像技术领域，涉及一种透射式共焦cars显微光谱测试方法及装置，可用于快速检测被测透明样品的几何形貌并获得微区cars光谱，实现高空间分辨的层析图谱成像。

技术背景

传统的共焦拉曼显微技术由于拉曼散射本身特性导致其散射光谱信号极弱，即便用高强度的激光激发，要得到一副对比度好的光谱图像，依然需要很长的作用时间。这种长时间作用限制了拉曼显微技术在生物领域的应用。基于相干拉曼效应的相干反斯托克斯拉曼散射(cars)过程能够很大程度上增强拉曼信号，从而实现快速检测。相干拉曼效应是通过受激激发的光将分子锁定在振动能级上，这种方法产生的振动信号的强度与激发光的强度成非线性关系，可以产生很强的信号，也称为相干非线性拉曼光谱。它具有很强的能量转换效率，曝光时间短，对样品的损害也比较小，同时它的散射具有一定的方向性，容易与杂散光分离。

相干反斯托克斯拉曼散射(cars)的产生是一个三阶非线性光学过程，它需要泵浦光、斯托克斯光和探测光。一般而言，为了减少光源的数量，简化过程，常用泵浦光代替探测光，它们之间的关系如图2所示，当泵浦光(wp)和斯托克斯光(ws)的频率之差与拉曼活性分子的振动频率相匹配时，将激发出cars光was，其中was＝2wp-ws。cars光的产生过程包含特定的拉曼活性分子的振动模式和导致分子从基态至激发态振动跃迁的入射光场的相互作用过程，它的能级示意图如图3所示。图3(a)表示拉曼共振和非共振单光子增强对cars过程的贡献，图3(b)表示拉曼共振和非共振双光子增强对cars过程的贡献；当ep和es之间的频差与拉曼活性分子的振动频率相匹配时，激发出的信号得到共振增强。

现有的cars显微技术大多采用两个单波长激光器进行光谱激发，因此只能获得特定频谱的光谱信息，而且并没有强调系统的定焦能力，导致实际光谱探测位置往往处于离焦位置。即便离焦位置也能激发出样品的拉曼光谱并被针孔后的光谱仪探测，但是强度并不能合理表征该点正确的光谱信号强度。这样导致cars显微系统探测微区光谱的能力受到很大限制，并制约了其在更精细微区光谱测试与分析场合中的应用。

此外，大多数光谱检测技术及装置是基于反射式结构，在检测透明材料时效果不佳。基于上述情况，本发明针对测量透明样品提出将系统收集到的样品中散射的强于样品拉曼散射光10³～10⁶倍的瑞利光进行高精度探测，使其与光谱探测系统有机融合，进行空间位置信息和光谱信息的同步探测，以实现高空间分辨的、高光谱分辨的共焦cars图谱成像和探测。

本发明专利的核心思想是基于检测透明样品的需求，提出透射式共焦cars显微光谱测量方法与装置。其中，选用单波长脉冲激光器和超连续谱脉冲激光器作为激发光源，扩大激发光谱范围，提高光谱激发强度；将共焦显微结构与cars光谱结构结合，利用共焦响应曲线的“最大值点”与显微物镜焦点位置精确对应这一特性，精确定焦，实现高空间分辨；精确定焦后，进行光谱探测，获得最佳光谱分辨能力；将光谱信息和几何信息融合，实现层析图谱探测与测量。

技术实现要素：

本发明的目的是为克服现有技术的不足，提出一种透射式共焦cars显微光谱测试方法及装置，用于检测透明样品。

本发明是通过以下技术方案实现的。一种激光共焦cars光谱测试方法，包括以下步骤：

a)在激光发射单元(1)中，由超连续谱激光器(3)发出超连续谱激光，经过一个带通滤光片(4)得到要求谱段的斯托克斯光后，通过一个二向色镜(5)与单波长激光器(2)发出的单波长激光混合，形成混合光束(频率一致，时间一致，空间重合)进入光谱激发单元(6)；

b)在光谱激发单元(6)中，混合光束经第一反射镜(7)反射通过显微物镜(8)，聚焦在固定在三维扫描平台(9)上的被测样品(10)上，激发出瑞利光和载有被测样品(10)光谱特性的反斯托克斯(cars)光，通过样品后形成的混合光束包含瑞利光、斯托克斯光、cars光；

c)混合光束被显微物镜(11)收集，经过二向色镜(12)后分成两束，其中包含cars光的光束进入光谱探测单元(13)，另一束包含瑞利光的光束进入共焦探测系统(19)；在光谱探测单元(13)中，包含cars光的光束先经过带通滤光片(14)，滤除光束中的非cars干扰光，然后通过第一聚光镜(15)会聚进入光谱仪(18)，获得cars光谱信息；另一束载有瑞利光的光束通过第三聚光镜(20)后通过位于焦点位置的第二针孔(21)滤除杂散光后被光电探测器(22)探测，获得共焦信号。三维平移台(9)z向移动，共焦信号强度随之改变，得到共焦响应曲线(24)，利用共焦响应曲线“最大值”点与显微物镜(8)焦点位置精确对应这一特性，得到被测样品z向几何位置，结合三维平移台(9)横向位置，得到被测样品几何形貌i(x,y,z)。

d)通过三维平移台(9)使显微物镜精确定焦后，通过光谱探测单元(13)获得当前测量点的光谱信息i(λ)；将几何位置和光谱信息结合，系统能获得高空间分辨的微区图谱层析图像，即实现了透射式共焦cars显微光谱探测。

特别的，在本发明方法中，激光发射单元中，单波长脉冲激光器(2)与超连续谱脉冲激光器(3)为重复频率一致的脉冲激光器。

特别的，通过匹配不同谱带的滤光片，选择不同谱段的斯托克斯光，来实现不同谱段的光谱探测。

特别的，在本发明方法中，激光发射单元(1)的实现方式还包括采用一个单波长脉冲激光器添加光子晶体光纤(26)进行超连续谱扩展后与单波长激光进行混合输出。

特别的，在本发明方法中，激发cars光的方式还包括反向激发的方式。

一种透射式共焦cars显微光谱测试装置，包括以下五个部分：激光发射单元(1)、光谱激发单元(6)、光谱探测单元(13)、共焦探测单元(19)、计算机(33)。激光发射单元(1)由单波长脉冲激光器(2)、超连续谱脉冲激光器(3)、带通滤光片(4)和二向色镜(5)组成；光谱激发单元由第一反射镜(7)、第一显微物镜(8)、三维平移台(9)、被测样品(10)、第二显微物镜(11)、二向色镜(12)组成；光谱探测单元(13)由带通滤光片(14)、第一聚光镜(15)、第一针孔(16)、第二聚光镜(17)、光谱仪(18)组成；共焦探测单元(19)由第三聚光镜(20)、第一针孔(21)、第一光电探测器(22)组成。

在本发明装置中，光谱探测单元(13)位于二向色镜(12)透射方向，共焦探测单元(19)位于二向色镜(12)反射方向，计算机(33)与三维平移台(9)、光谱探测单元(13)、共焦探测单元(19)连接，用于融合并处理光谱数据和位置信息。

在本发明装置中，光谱探测单元(13)还可以是由带通滤光片(14)、第一聚光镜(15)、光谱仪(18)构成的普通光谱探测单元。

在本发明装置中，cars光激发模式包括：当单波长激光器(2)发出的光作为泵浦光和探测光时，连续谱激光器(3)发出的连续谱激光作为斯托克斯光；当单波长激光器(2)发出的光作为斯托克斯光和探测光时，连续谱激光器(3)发出的连续谱激光作为泵浦光。

在本发明装置中，在激光发射单元(1)和光谱激发单元(6)之间添加偏振调制器形成偏振光束以提高光谱激发信号信噪比，或添加光瞳滤波器(32)产生结构光束以提高几何分辨力；

有益效果

本发明方法，对比已有技术具有以下显著优点：

1、本发明融合透射式共焦显微技术和cars光谱探测技术，通过共焦显微技术实现高精度几何测量和定焦，定焦后对样品进行cars光谱激发和测量，大幅提高现有cars光谱显微镜的微区光谱探测能力；

2、本发明采用双对称显微物镜，可通过计算机实现同步切换，提高了仪器的操作性能；

3、本发明采用的两个激光器为启动时间一致、重复频率一致的窄脉冲飞秒激光器，光路稳定，激发效率高。

4、本发明即可实现微区三维形貌测量与成像，也可实现微区光谱测量与成像，还可以将两者结合实现高空间分辨的图谱层析成像；

5、本发明采用的是透射结构，弥补了反射式光谱测量方法在测量透明样品信号强度弱、不易采集等不足；

附图说明

图1为摘要附图，即本发明基本实施图；

图2为相干反斯托克斯(cars)光激发原理图；

图3为cars光与泵浦光、斯托克斯光的能级关系图；

图4为透射式共焦cars显微光谱测量方法示意图；

图5为改进光谱探测的透射式共焦cars显微光谱测量方法示意图；

图6为多层样品测量示意图

图7为单激光器实现的透射式共焦cars显微光谱测量方法示意图；

图8为时域扫描的透射式共焦cars显微光谱测量方法示意图；

图9为反向激发的透射式共焦cars显微光谱测试方法示意图；

图10为加光瞳滤波器的透射式共焦cars显微光谱测试方法示意图；

图11为透射式共焦cars显微光谱测试装置示意图,即实施例用图；

其中，1-激光发射单元、2-单波长激光光源、3-超连续谱激光光源、4-带通滤光片、5-二向色镜、6-光谱激发单元、7-第一反射镜、8-第一显微物镜、9-三维平移台、10-被测样品、11-第二显微物镜、12-二向色镜、13-光谱探测单元、14-带通滤光片、15-第一聚光镜、16-第一针孔、17-第二聚光镜、18-光谱仪、19-共焦探测单元、20-第三聚光镜、21-第二针孔、22-光电探测器、23-聚焦光斑、24-多层共焦曲线、25-偏振分光棱镜、26-光子晶体光纤、27-第二反射镜、28-光学延时器、29-第三反射镜、30-偏振片、31-光电点探测器、32-光瞳滤波器、33-计算机；

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细说明。

如图4所示，激光发射单元(1)产生空间重合、时间一致的混合光束(斯托克斯光和泵浦光)，进入光谱激发单元(6)；在光谱激发单元(6)中，光束经第一反射镜(7)反射至显微物镜(8)，由高倍显微物镜(8)紧聚焦在被测样品(10)上，激发出瑞利光和载有被测样品光谱特性的cars光；cars光、瑞利光和残余的斯托克斯光被第二显微物镜(11)收集，经二向色镜(12)分光，其中cars光和斯托克斯光进入光谱探测单元(13)进行光谱探测，瑞利光进入共焦探测单元(19)进行几何位置测量；

在光谱探测单元(13)中添加第一针孔(16)过滤杂散光提高光谱探测的信噪比，即构成图5；

图6为本方法探测透明多层样品示意图，三维平移台(9)沿z向移动，使显微物镜(8)聚焦在被测多层样品(10)上的光斑(23)大小改变，相应的光谱探测单元和共焦探测单元收集到的cars光谱信号和瑞利信号强度改变，z向位置和共焦信号强度变化构成共焦曲线(24)，当显微物镜(8)聚焦在不同层时，得到多层共焦曲线(24)，得到多层共焦曲线(24)的多个峰值点位置，实现对被测样品(10)的分层聚焦探测；

将图4中由双激光器组成的激光发射单元换成单激光器与光子晶体光纤组合结构，即构成图7；在图7中，单波长脉冲激光器(2)发出单波长脉冲激光，经过偏振分光棱镜(25)分光，一半光经过光子晶体光纤(26)进行超连续谱扩展获得超连续谱激光，通过带通滤光片(4)选择需要特定波长的激光后，与另一半单波长激光在二向色镜(5)处重合，通过调整光学延时器(28)保证两束激光时序重合，从而满足cars光激发的空间重合、时间一致的要求。

在图7中的偏振分光棱镜(25)和光子晶体光纤(26)之间添加偏振片(30)，并将光谱探测单元(13)中的光谱仪换成响应迅速、探测灵敏的光电点探测器(31)，即构成图8；这样通过旋转偏振片(30)，改变入射光子晶体光纤(26)的激光偏振态，使输出的连续谱激光的波长变换，实现光谱的时域扫描输出，结合光电点探测器(31)可实现cars光谱的时域扫描探测，这是本发明方法激发探测cars光谱的方法之一。

在本发明方法中，除了采用上述同向激发、反向探测的方法激发cars光，还可以采用反向激发、反向探测的方法。如图9所示，单波长激光器(2)发出的单波长激光通过二向色镜(5)反射通过第二显微物镜(11)会聚在样品上，而超连续谱激光器(3)发出的连续谱激光通过反射镜(7)反射通过第一显微物镜(8)会聚在样品(10)上；两束光会聚在样品上的位置一样，保证两束脉冲激光到达样品位置时序一致，激发出瑞利光和载有被测样品光谱特性的cars光，分别进入光谱探测单元(13)和共焦探测单元(19)进行几何位置探测。

基于本发明基本实施方法，在激光发射单元(1)和光谱激发单元(6)间添加光瞳滤波器(32)，即构成图10；此时，通过引入结构光束，使系统的空间分辨力能得到提高；

实施例

在本实施例中，采用波长为800nm的飞秒激光器作为泵浦光源和探测光源，采用重复频率与之一致的超连续谱(400～2000nm)皮秒激光器作为斯托克斯光源。

如图11所示,透射式共焦cars显微光谱测试装置，其测试步骤如下：

在激光发射单元(1)中，单波长脉冲激光器(2)与超连续谱脉冲激光器(3)同时发出脉冲激光，超连续谱激光通过带通滤光片(4)选择出合适的斯托克斯光(810～950nm)与单波长激光(900nm)在二向色镜(5)处汇合，保证两束激光汇合后，空间重合(单波长激光包络于连续谱激光)、时间一致(两束激光到达分光片的光程一致)；

混合后的光束通过高倍显微物镜(8)紧聚焦在被测样品(10)上，此时满足相位匹配条件，激发出瑞利光和波长范围在690～790nm的载有被测样品光谱特性的反斯托克斯光(cars)。其中cars光进入光谱探测单元(13)探测，瑞利光进入共焦探测单元(19)进行几何位置探测。

在标准测量模式下，计算机控制三维平移台(9)在x-y方向移动实现横向扫描，测量单点时，计算机控制三维平移台z向移动，此时被测样品(10)上的光斑(23)大小改变，相应的共焦探测单元(19)获得的共焦信号强度i(z)改变，根据共焦强度响应曲线(24)最大值点对应显微物镜(8)焦点位置，获得被测点的几何位置信息i(x,y,z)；此时，通过三维平移台(9)使被测样品(10)移动到物镜焦点位置，通过光谱探测单元(13)测量此时的光谱信号i(λ)，结合三维平移台位置获得光谱信息i(x,y,λ)，通过计算机(33)将几何位置信息i(x,y,z)和光谱信息i(x,y,λ)融合，获得高空间分辨的光谱图像信息i(x,y,z,λ)。三者之间的联系如下：

微区图谱层析成像

通过对几何位置信息i(x,y,z)和光谱信息i(x,y,λ)融合处理，能够实现微区图谱成像i(x,y,z,λ)。

如图11所示，透射式共焦cars显微光谱测试装置包括激光发射单元1、光谱激发单元(6)、光谱探测单元(13)、共焦探测单元(19)、计算机(33)；其中激光发射单元(1)包括单波长激光光源(2)、超连续谱激光光源(3)、带通滤光片(4)、二向色镜(5)；光谱激发单元(6)包括第一反射镜(7)、第一显微物镜(8)、三维平移台(9)、被测样品(10)、第二显微物镜(11)、二向色镜(12)；光谱探测单元(13)包括带通滤光片(14)、第一聚光镜(15)、第一针孔(16)、第二聚光镜(17)、光谱仪(18)；共焦探测单元(19)包括第三聚光镜(20)、第二针孔(21)、光电探测器(22)；

其中，光谱激发单元(1)位于光谱激发单元(6)中反射镜(7)的入射方向，光谱探测单元位于光谱激发单元(6)中二向色镜(12)的透射方向，共焦探测单元(19)位于二向色镜(12)的反射方向；

在整个系统中，单波长激光光源(2)、超连续谱激光光源(3)、三维平移台(9)、光谱仪(18)、光电探测器(22)均受计算机(33)控制，系统得到的三维位置信息和光谱信息也由计算机(33)进行融合处理。

以上结合附图对本发明的具体实施方式作了说明，但这些说明不能被理解为限制了本发明的范围，本发明的保护范围由随附的权利要求书限定，任何在本发明权利要求基础上进行的改动都是本发明的保护范围。