一种禾本科植物叶片表皮层气孔密度的估测方法与流程

本发明涉及植物学领域，具体是一种禾本科植物叶片表皮层气孔密度的估测方法。

背景技术：

植物叶片的气孔密度会影响植物的光合作用和蒸腾作用，是表征植物叶片气孔特性的重要参数之一。目前大部分研究都是通过人工计数进行气孔密度的测量，该方法不但浪费劳动力，而且当数据量很大时，人工很容易因为疲劳出现错误，还会受外界环境因素的影响，无法及时对采集的数据进行处理。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种禾本科植物叶片表皮层气孔密度的估测方法，通过对光学显微镜采集到的样本叶片表皮标本图像进行处理，得到视场内样本叶片的气孔数量，从而计算得到样本叶片的气孔密度。

为解决上述技术问题，本发明提供一种禾本科植物叶片表皮层气孔密度的估测方法，包括以下步骤：

(1)样本叶片的准备：

选取株型健壮、发育正常的禾本科植物叶片为估测对象，量取叶片总长度，在距离叶片长度中间2～3cm处分别横向剪断叶片，然后在距离主叶脉0.5～2cm处纵向剪掉主叶脉一侧的边缘叶片，最后沿着主叶脉纵向剪掉包括主叶脉的另外一半叶片，作为样本叶片，标记叶片样品的上、下表皮后，迅速置于提前预冷的faa固定液中保存备用；

(2)表皮标本的制作：

①、用镊子轻轻夹取保存在faa固定液中的样本叶片，放置在预先准备好的白色滤纸上，用两个载玻片左右横向压住样本叶片以保持叶片平整，室温放置晾干或用脱脂棉拭去叶片表面液体；

②、蘸取无色指甲油或透明胶，均匀的涂抹在样本叶片表面，室温放置使指甲油或透明胶干燥；

③、用透明胶带粘在涂有指甲油或透明胶的样本叶片表面，赶走透明胶带底部气泡，使透明胶带和样本叶片表层紧密粘在一起；

④、迅速撕下透明胶带，使透明胶带连同指甲油或透明胶一起被撕下，将撕下的透明胶带粘在载玻片上，标注上表皮或下表皮标本；

⑤、用镊子将样本叶片翻转过来，利用同样的办法，制作样本叶片另一面的表皮标本；

(3)气孔观察：

利用光学显微镜观察表皮标本的气孔细胞分布，选择视场内没有杂质，且气孔数目分布尽可能多的观察视场，拍摄图片，并保存，每个表皮标本拍摄n张图片，n≥5；

(4)气孔密度计算：

数出n张图片的气孔数目总和，按下式计算，分别获得叶片样品上表皮层和下表皮层的气孔密度：

为简单说明问题起见，以下对本发明所述的禾本科植物叶片表皮层气孔密度的估测方法均简称为本方法。

本方法通过对显微镜采集到的样本叶片图像进行处理，得到视场内样本叶片的气孔数量，从而计算得到样本叶片的气孔密度，能够快速获取样本叶片的气孔密度，而且效率较高。

附图说明

图1是实施例1拍摄的高粱叶片下表皮的气孔图像。

图2是实施例2拍摄的小麦叶片下表皮的气孔图像

具体实施方式

实施例1

高粱叶片表皮层气孔密度的估测方法，包括以下步骤：

(1)样本叶片的准备：

在高粱灌浆初期，选取株型健壮、发育正常、距离高粱植株顶端的第三片叶片为估测对象，量取叶片总长度，在距离叶片长度中间3cm处分别横向剪断叶片，然后在距离主叶脉2cm处纵向剪掉主叶脉一侧的边缘叶片，最后沿着主叶脉纵向剪掉包括主叶脉的另外一半叶片，作为样本叶片，计算样本叶片的面积为6cm×2cm＝12cm²，标记叶片样品的上、下表皮后，迅速置于提前预冷的faa固定液中保存备用；

(2)表皮标本的制作：

①、用镊子轻轻夹取保存在faa固定液中的样本叶片，放置在预先准备好的白色滤纸上(注意区别样本叶片上、下表皮)，用两个载玻片左右横向压住样本叶片以保持样本叶片平整，室温放置并用脱脂棉擦拭，使叶片表面液体晾干；

②、用微小的刷子蘸取透明胶，均匀的涂抹在样本叶片表面，室温放置并适当扇风使透明胶干燥；

③、用4cm×2.5cm的透明胶带粘在涂有指甲油的样本叶片表面，赶走透明胶带底部气泡，使透明胶带和样本叶片表层紧密粘在一起；

④、迅速撕下透明胶带，使透明胶带连同指甲油一起被撕下，并保证指甲油的完整性，将撕下的透明胶带粘在载玻片上，记号笔标注上表皮或下表皮标本；

⑤、用镊子将样本叶片翻转过来，利用同样的办法，制作样本叶片另一面的表皮标本；

(3)气孔观察：

打开光学显微镜和连接显微镜的电脑，利用放大倍数100×(目镜10×，物镜10×)下观察，启动显微镜操作软件，矫正显微镜白平衡参数；将制作的表皮标本+载玻片放置在载物台上，推片器弹簧夹夹住，然后旋转推片器螺旋，将所要观察的部位调到通光孔的正中，调节细准焦螺旋至可以观察到清晰的图像为止；观察表皮标本的气孔细胞分布，选择视场内没有杂质，且气孔数目分布尽可能多的观察视场，拍摄图片，并保存，每个表皮标本拍摄10张图片，如图1所示；

(4)气孔密度计算：

数出10张图片的气孔数目总和，按下式计算，分别获得叶片样品上表皮层和下表皮层的气孔密度：

其中faa固定液(100ml)含有89ml60％的乙醇、5ml38％的甲醛和6ml冰醋酸。60％的乙醇的配置方法是：量取无水乙醇60ml，加入40mlddh2o(双蒸水)。38％的甲醛的配制方法是：量取38ml甲醛，加入62mlddh2o。

faa固定液现配现用。

实施例2

小麦叶片表皮层气孔密度的估测方法，包括以下步骤：

(1)样本叶片的准备：

在小麦灌浆初期，选取株型健壮、发育正常、从植株顶端数起的第四片叶片为估测对象，量取叶片总长度，在距离叶片长度中间2cm处分别横向剪断叶片，然后在距离主叶脉0.5cm处纵向剪掉主叶脉一侧的边缘叶片，最后沿着主叶脉纵向剪掉包括主叶脉的另外一半叶片，作为样本叶片，计算样本叶片的面积为4cm×0.5cm＝2.0cm²，标记叶片样品的上、下表皮后，迅速置于提前预冷的faa固定液中保存备用；

(2)表皮标本的制作：

①、用镊子轻轻夹取保存在faa固定液中的样本叶片，放置在预先准备好的白色滤纸上(注意区别样本叶片上、下表皮)，用两个载玻片左右横向压住样本叶片以保持样本叶片平整，室温放置30s晾干；

②、用微小的刷子蘸取无色指甲油，均匀的涂抹在样本叶片表面，室温放置使指甲油干燥；

③、用3cm×1.0cm的透明胶带粘在涂有透明胶的样本叶片表面，赶走透明胶带底部气泡，使透明胶带和样本叶片表层紧密粘在一起；

④、迅速撕下透明胶带，使透明胶带连同透明胶一起被撕下，并保证透明胶的完整性，将撕下的透明胶带粘在载玻片上，记号笔标注上表皮或下表皮标本；

⑤、用镊子将样本叶片翻转过来，利用同样的办法，制作样本叶片另一面的表皮标本；

(3)气孔观察：

打开光学显微镜和连接显微镜的电脑，利用放大倍数100×(目镜10×，物镜10×)下观察，启动显微镜操作软件，矫正显微镜白平衡参数；将制作的表皮标本+载玻片放置在载物台上，推片器弹簧夹夹住，然后旋转推片器螺旋，将所要观察的部位调到通光孔的正中，调节细准焦螺旋至可以观察到清晰的图像为止；观察表皮标本的气孔细胞分布，选择视场内没有杂质，且气孔数目分布尽可能多的观察视场，拍摄图片，并保存，每个表皮标本拍摄5张图片，如图2所示；

(4)气孔密度计算：

数出5张图片的气孔数目总和，按下式计算，分别获得叶片样品上表皮层和下表皮层的气孔密度：

其中faa固定液(100ml)含有89ml60％的乙醇、5ml38％的甲醛和6ml冰醋酸。60％的乙醇的配置方法是：量取无水乙醇60ml，加入40mlddh2o(双蒸水)。38％的甲醛的配制方法是：量取38ml甲醛，加入62mlddh2o。配制好的faa固定液4℃低温保存，且在一个月内使用。