一种提取红曲酒中桔霉素毒素的方法与流程

本发明属于生物
技术领域：
，具体涉及一种提取红曲酒中桔霉素毒素的方法。
背景技术：
：桔霉素主要是由青霉属、曲霉属、红曲霉属所产生的一种真菌毒素。桔霉素分布广泛，主要存在于小麦、玉米、燕麦等谷物产品，以及苹果、梨等水果的加工制品中。桔霉素具有良好的抑菌性，能抑制枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、灰色链霉菌等，但由于桔霉素有很强的肾毒性而没有广泛应用，而且其污染问题越来越受到人们的关注，并被国际生命科学院自然毒素检测委员会欧洲分会列为必须检测的毒素之一。中国是世界上红曲生产与应用最早、最广的国家，而红曲酒在我国也已经有了一千多年的历史，其品种多、品质好、功能强，逐渐受到国内外的广泛关注。红曲酒中桔霉素毒素含量也成为我国红曲酒出口检验检疫的主要内容。国内外基于不同的检测方法对农产品、食品、饲料中所含的桔霉素毒素含量设立了不同的限制标准，随着hplc技术的不断完善，检测工作日趋简单，而样品的前处理成了技术关键和难点。目前对于桔霉素毒素分离纯化方法较为复杂，普遍都是通过浓缩、过柱、萃取实现桔霉素毒素分离，最后通过tlc或者hplc进行定性定量检测。技术实现要素：本发明的一个目的是提供一种提取红曲酒中桔霉素毒素的方法。本发明提供的提取红曲酒中桔霉素毒素的方法包括如下步骤：将红曲酒与甲醇混匀，反应，得到产物，即得到桔霉素毒素。上述方法中，所述红曲酒和甲醇的体积比为1：(0.7-2)；所述红曲酒和甲醇的体积比具体为1：1。上述方法中，所述甲醇为色谱级甲醇。上述方法中，所述反应的条件为室温、200rpm振荡30-120min；所述振荡时间具体为60min。上述方法中，所述将红曲酒与甲醇溶液混匀前还包括将红曲酒充分混匀的步骤。上述方法中，所述方法还包括对所述产物进行hplc检测的步骤。本发明的另一个目的是提供上述方法的新用途。本发明提供了上述方法在检测红曲或其相关产品中桔霉素毒素含量中的应用。上述应用中，所述红曲或其相关产品为红曲酒。本发明的最后一个目的是提供一种检测红曲酒中桔霉素毒素含量的方法。本发明提供的检测红曲酒中桔霉素毒素含量的方法包括如下步骤：用上述方法提取红曲酒中桔霉素毒素，得到桔霉素毒素待测样品，采用高效液相色谱法对所述桔霉素毒素待测样品进行检测，得到红曲酒中桔霉素毒素含量。上述方法或上述应用中，所述红曲酒具体可为市售红曲酒和造酒厂中未售红曲原酒。本发明利用桔霉素易溶于乙腈、甲醇、乙酸乙酯、丙酮等有机溶剂的理化性质，发明了一种更为简便的提取红曲酒中桔霉素毒素的方法，有利于推动红曲以及红曲酒业的发展。经试验证明，本发明的方法能够快速提取红曲酒中桔霉素毒素，且效率高、耗时少、成本低、回收率高(<100ng/ml，回收率范围在60-120％；100-1000ng/ml，回收率范围在80-110％)，符合实验室质量控制规范-食品理化检测标准(gb/t27404)，另外，此方法也极大简便了红曲及其相关产品中桔霉素毒素的提取，具有极高的推广和应用价值。附图说明图1为桔霉素毒素含量检测标准曲线图谱。图2为2000ng/ml桔霉素毒素标准品的hplc图谱。图3为红曲酒样品a的hplc图谱及在红曲酒样品a中加入100μl不同浓度的桔霉素毒素标准品后的hplc图谱。其中，图3a为红曲酒样品a的hplc图谱；图3b为在红曲酒样品a中加入100μl2000ng/ml桔霉素毒素标准品后的hplc图谱；图3c为在红曲酒样品a中加入100μl1000ng/ml桔霉素毒素标准品后的hplc图谱；图3d为在红曲酒样品a中加入100μl500ng/ml桔霉素毒素标准品后的hplc图谱。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中的桔霉素标准品是sigma公司(美国)的产品。下述实施例中的色谱级甲醇是fisher公司(美国)的产品。桔霉素标准曲线的制作方法如下所示：用1ml色谱级甲醇溶1mg固体桔霉素标准品，配制成1000mg/l桔霉素标准溶液，再用色谱级甲醇溶液分别配制成2000ng/ml，1000ng/ml，500ng/ml，100ng/ml，50ng/ml，10ng/ml标准曲线工作液。采用高效液相色谱法对不同浓度的标准曲线工作液进行hplc定量检测，并以桔霉素浓度作横坐标，以保留时间前后0.05min处的峰面积作纵坐标，根据浓度与峰面积的关系进行线性回归，并绘制标准曲线。其中，高效液相色谱法条件：色谱柱：agilenttc-c18，4.6×250mm，5μm；流动相：乙腈/异丙醇/磷酸(0.08mol/l)(35/10/55，v/v/v)；荧光检测器：安捷伦g1321；检测波长：331nm和500nm；流速：1.0ml/min；柱温40℃；进样量：50μl。绘制的标准曲线如图1所示。根据标准曲线得到的标准曲线方程为：y＝0.15375654x-1.8281142(y为峰面积，x为桔霉素毒素含量)，r2＝0.99987。图2为2000ng/ml桔霉素毒素标准品的hplc图谱。桔霉素毒素标准品溶液回收率的检测方法如下所示：用移液器准确量取1.9ml色谱级甲醇后，置于10ml离心管内，分别加入100μl的浓度为2000ng/ml，1000ng/ml，500ng/ml桔霉素毒素标准品，上下颠倒数次至混合均匀后，转至2ml微量进样瓶中，进行hplc定量检测，以外标法定量进行数据处理。每种桔霉素毒素标准添加标准品重复3次，取平均值。结果表明：1ml样品中理论添加桔霉素毒素含量分别为200ng/ml，100ng/ml，50ng/ml，实际检测平均值(即为下述实施例中的添加桔霉素毒素标准品的实际检测值)分别为177.30ng/ml，94.23ng/ml，59.01ng/ml，回收率分别为88.65％，94.23％，118.01％。实施例1、一种提取红曲酒中桔霉素毒素的方法及桔霉素毒素含量的检测分别对红曲酒样品a(市售红曲酒)进行原始红曲酒中桔霉素毒素提取和桔霉素毒素标准添加样品中桔霉素毒素提取，然后进行hplc定量检测。具体步骤如下：1、原始红曲酒中桔霉素毒素提取用移液器准确量取1ml已充分混匀的红曲酒样品a，置于10ml离心管内，加入1ml色谱级甲醇，室温放置摇床上，200rpm剧烈震荡60min之后，转至2ml微量进样瓶中，采用高效液相色谱法(hplc)对样品液进行高效液相色谱分析，以外标法定量进行数据处理。红曲酒样品a重复3次，取平均值。高效液相色谱法条件：色谱柱：agilenttc-c18，4.6×250mm，5μm；流动相：乙腈/异丙醇/磷酸(0.08mol/l)(35/10/55，v/v/v)；荧光检测器：安捷伦g1321；检测波长：331nm和500nm；流速：1.0ml/min；柱温40℃；进样量：50μl。收集与桔霉素毒素标准品保留时间(保留时间约0.05min)一致的峰的洗脱液，得到原始红曲酒样品a中的桔霉素毒素含量。图3a为红曲酒样品a的hplc图谱。2、桔霉素毒素标准添加样品中桔霉素毒素提取用移液器准确量取1ml已充分混匀的红曲酒样品a，置于10ml离心管内，分别加入100μl的浓度为2000ng/ml，1000ng/ml，500ng/ml桔霉素毒素标准品，上下颠倒数次至混合均匀后，再加入0.9ml色谱级甲醇，室温放置摇床上，200rpm剧烈震荡60min之后，转至2ml微量进样瓶中。采用高效液相色谱法(hplc)分别对样品液进行高效液相色谱分析，以外标法定量进行数据处理，分别得到桔霉素毒素标准添加样品中的桔霉素毒素含量，再分别计算回收率。每种桔霉素毒素标准添加红曲酒样品重复3次，取平均值。检测结果如表1所示。其中，实际含量(ng/ml)为红曲酒样品中桔霉素毒素含量的实际平均检测值；理论含量(ng/ml)为红曲酒样品中分别加入0，2000ng/ml，1000ng/ml，500ng/ml桔霉素毒素标准品后的理论含量；回收率(％)为实际含量/理论含量*100％。当加标浓度为0时，桔霉素毒素含量为30.90ng/ml(即为原始红曲酒样品a中的桔霉素毒素平均含量)；当加标浓度为2000ng/ml时，桔霉素毒素含量为216.27ng/ml，理论含量为230.90ng/ml(200.00ng/ml+30.90ng/ml)，回收率为93.66％(216.27ng/ml/230.90ng/ml)。当加标浓度为1000ng/ml时，桔霉素毒素含量为127.77ng/ml，理论含量为130.90ng/ml(100.00ng/ml+30.90ng/ml)，回收率为97.61％(127.77ng/ml/130.90ng/ml)。当加标浓度为500ng/ml时，桔霉素毒素含量为79.22ng/ml，理论含量为80.90ng/ml(50.00ng/ml+30.90ng/ml)，回收率为97.92％(97.92ng/ml/80.90ng/ml)。以上加标回收率均符合实验室质量控制规范-食品理化检测标准(gb/t27404)(加标浓度<100ng/ml，回收率范围在60-120％；100-1000ng/ml，回收率范围在80-110％)，说明本发明提取的桔霉素毒素的方法是可行的，且该方法更加简便。图3b为在红曲酒样品a中加入100μl2000ng/ml桔霉素毒素标准品后的hplc图谱；图3c为在红曲酒样品a中加入100μl1000ng/ml桔霉素毒素标准品后的hplc图谱；图3d为在红曲酒样品a中加入100μl500ng/ml桔霉素毒素标准品后的hplc图谱。表1红曲酒样品a中桔霉素毒素含量检测加标浓度(ng/ml)实际含量(ng/ml)理论含量(ng/ml)回收率(％)030.9030.902000216.27230.9093.661000127.77130.9097.6150079.2280.9097.92实施例2、一种提取红曲酒中桔霉素毒素的方法及桔霉素毒素含量的检测分别对红曲酒样品b(市售红曲酒)进行原始红曲酒中桔霉素毒素提取和桔霉素毒素标准添加样品中桔霉素毒素提取，然后进行hplc定量检测。具体步骤如下：1、原始红曲酒中桔霉素毒素提取用移液器准确量取1ml已充分混匀的红曲酒样品b，置于10ml离心管内，加入1ml色谱级甲醇，室温放置摇床上，200rpm剧烈震荡60min之后，转至2ml微量进样瓶中，采用高效液相色谱法(hplc)对样品液进行高效液相色谱分析，以外标法定量进行数据处理。红曲酒样品b重复3次，取平均值。高效液相色谱法条件：色谱柱：agilenttc-c18，4.6×250mm，5μm；流动相：乙腈/异丙醇/磷酸(0.08mol/l)(35/10/55，v/v/v)；荧光检测器：安捷伦g1321；检测波长：331nm和500nm；流速：1.0ml/min；柱温40℃；进样量：50μl。收集与桔霉素毒素标准品保留时间(保留时间约0.05min)一致的峰的洗脱液，得到原始红曲酒样品b中的桔霉素毒素含量。2、桔霉素毒素标准添加样品中桔霉素毒素提取用移液器准确量取1ml已充分混匀的红曲酒样品b，置于10ml离心管内，分别加入100μl的浓度为2000ng/ml，1000ng/ml，500ng/ml桔霉素毒素标准品，上下颠倒数次至混合均匀后，再加入0.9ml色谱级甲醇，室温放置摇床上，200rpm剧烈震荡60min之后，转至2ml微量进样瓶中。采用高效液相色谱法(hplc)分别对样品液进行高效液相色谱分析，以外标法定量进行数据处理，分别得到桔霉素毒素标准添加样品中的桔霉素毒素含量，再分别计算加标回收率。每种桔霉素毒素标准添加红曲酒样品重复3次，取平均值。检测结果如表2所示。当加标浓度为0时，桔霉素毒素含量为30.39ng/ml(即为原始红曲酒样品b中的桔霉素毒素平均含量)；当加标浓度为2000ng/ml时，桔霉素毒素含量为210.73ng/ml，理论含量为230.39ng/ml(200.00ng/ml+30.39ng/ml)，回收率为91.47％(210.73ng/ml/230.39ng/ml)。当加标浓度为1000ng/ml时，桔霉素毒素含量为119.87ng/ml，理论含量为130.39ng/ml(100.00ng/ml+30.39ng/ml)，回收率为91.93％(119.87ng/ml/130.39ng/ml)。当加标浓度为500ng/ml时，桔霉素毒素含量为75.44ng/ml，理论含量为80.39ng/ml(50.00ng/ml+30.39ng/ml)，回收率为93.84％(75.44ng/ml/80.39ng/ml)。以上加标回收率均符合实验室质量控制规范-食品理化检测标准(gb/t27404)(加标浓度<100ng/ml，回收率范围在60-120％；100-1000ng/ml，回收率范围在80-110％)，说明本发明提取的桔霉素毒素的方法是可行的，且该方法更加简便。表2红曲酒样品b中桔霉素毒素含量检测加标浓度(ng/ml)实际含量(ng/ml)理论含量(ng/ml)回收率(％)030.3930.392000210.73230.3991.471000119.87130.3991.9350075.4480.3993.84实施例3、一种提取红曲酒中桔霉素毒素的方法及桔霉素毒素含量的检测分别对红曲酒样品c(市售红曲酒)进行原始红曲酒中桔霉素毒素提取和桔霉素毒素标准添加样品中桔霉素毒素提取，然后进行hplc定量检测。具体步骤如下：1、原始红曲酒中桔霉素毒素提取用移液器准确量取1ml已充分混匀的红曲酒样品c，置于10ml离心管内，加入1ml色谱级甲醇，室温放置摇床上，200rpm剧烈震荡60min之后，转至2ml微量进样瓶中，采用高效液相色谱法(hplc)对样品液进行高效液相色谱分析，以外标法定量进行数据处理。红曲酒样品c重复3次，取平均值。高效液相色谱法条件：色谱柱：agilenttc-c18，4.6×250mm，5μm；流动相：乙腈/异丙醇/磷酸(0.08mol/l)(35/10/55，v/v/v)；荧光检测器：安捷伦g1321；检测波长：331nm和500nm；流速：1.0ml/min；柱温40℃；进样量：50μl。收集与桔霉素毒素标准品保留时间(保留时间约0.05min)一致的峰的洗脱液，得到原始红曲酒样品c中的桔霉素毒素含量。2、桔霉素毒素标准添加样品中桔霉素毒素提取用移液器准确量取1ml已充分混匀的红曲酒样品c，置于10ml离心管内，分别加入100μl的浓度为2000ng/ml，1000ng/ml，500ng/ml桔霉素毒素标准品，上下颠倒数次至混合均匀后，再加入0.9ml色谱级甲醇，室温放置摇床上，200rpm剧烈震荡60min之后，转至2ml微量进样瓶中。采用高效液相色谱法(hplc)分别对样品液进行高效液相色谱分析，以外标法定量进行数据处理，分别得到桔霉素毒素标准添加样品中的桔霉素毒素含量，再分别计算加标回收率。每种桔霉素毒素标准添加红曲酒样品重复3次，取平均值。检测结果如表3所示。当加标浓度为0时，桔霉素毒素含量为28.74ng/ml(即为原始红曲酒样品c中的桔霉素毒素平均含量)；当加标浓度为2000ng/ml时，桔霉素毒素含量为208.56ng/ml，理论含量为228.74ng/ml(200.00ng/ml+28.74ng/ml)，回收率为91.18％(208.56ng/ml/228.74ng/ml)。当加标浓度为1000ng/ml时，桔霉素毒素含量为118.25ng/ml，理论含量为128.74ng/ml(100.00ng/ml+28.74ng/ml)，回收率为94.99％(118.25ng/ml/128.74ng/ml)。当加标浓度为500ng/ml时，桔霉素毒素含量为73.54ng/ml，理论含量为78.74ng/ml(50.00ng/ml+28.74ng/ml)，回收率为93.40％(73.54ng/ml/78.74ng/ml)。以上加标回收率均符合实验室质量控制规范-食品理化检测标准(gb/t27404)(加标浓度<100ng/ml，回收率范围在60-120％；100-1000ng/ml，回收率范围在80-110％)，说明本发明提取的桔霉素毒素的方法是可行的，且该方法更加简便。表3红曲酒样品c中桔霉素毒素含量检测加标浓度(ng/ml)实际含量(ng/ml)理论含量(ng/ml)回收率(％)028.7428.742000208.56228.7491.181000118.25128.7491.8550073.5478.7493.40实施例4、一种提取红曲酒中桔霉素毒素的方法及桔霉素毒素含量的检测分别对红曲酒样品d(造酒厂中未售红曲原酒)进行原始红曲酒中桔霉素毒素提取和桔霉素毒素标准添加样品中桔霉素毒素提取，然后进行hplc定量检测。具体步骤如下：1、原始红曲酒中桔霉素毒素提取用移液器准确量取1ml已充分混匀的红曲酒样品d，置于10ml离心管内，加入1ml色谱级甲醇，室温放置摇床上，200rpm剧烈震荡60min之后，转至2ml微量进样瓶中，采用高效液相色谱法(hplc)对样品液进行高效液相色谱分析，以外标法定量进行数据处理。红曲酒样品d重复3次，取平均值。高效液相色谱法条件：色谱柱：agilenttc-c18，4.6×250mm，5μm；流动相：乙腈/异丙醇/磷酸(0.08mol/l)(35/10/55，v/v/v)；荧光检测器：安捷伦g1321；检测波长：331nm和500nm；流速：1.0ml/min；柱温40℃；进样量：50μl。收集与桔霉素毒素标准品保留时间(保留时间约0.05min)一致的峰的洗脱液，得到原始红曲酒样品d中的桔霉素毒素含量。2、桔霉素毒素标准添加样品中桔霉素毒素提取用移液器准确量取1ml已充分混匀的红曲酒样品d，置于10ml离心管内，分别加入100μl的浓度为2000ng/ml，1000ng/ml，500ng/ml桔霉素毒素标准品，上下颠倒数次至混合均匀后，再加入0.9ml色谱级甲醇，室温放置摇床上，200rpm剧烈震荡60min之后，转至2ml微量进样瓶中。采用高效液相色谱法(hplc)分别对样品液进行高效液相色谱分析，以外标法定量进行数据处理，分别得到桔霉素毒素标准添加样品中的桔霉素毒素含量，再分别计算加标回收率。每种桔霉素毒素标准添加红曲酒样品重复3次，取平均值。检测结果如表4所示。当加标浓度为0时，桔霉素毒素含量为74.39ng/ml(即为原始红曲酒样品d中的桔霉素毒素平均含量)；当加标浓度为2000ng/ml时，桔霉素毒素含量为260.94ng/ml，理论含量为274.39ng/ml(200.00ng/ml+74.39ng/ml)，回收率为95.10％(260.94ng/ml/274.39ng/ml)。当加标浓度为1000ng/ml时，桔霉素毒素含量为166.60ng/ml，理论含量为174.39ng/ml(100.00ng/ml+74.39ng/ml)，回收率为95.53％(166.60ng/ml/174.39ng/ml)。当加标浓度为500ng/ml时，桔霉素毒素含量为121.46ng/ml，理论含量为124.39ng/ml(50.00ng/ml+74.39ng/ml)，回收率为97.64％(121.46ng/ml/124.39ng/ml)。以上加标回收率均符合实验室质量控制规范-食品理化检测标准(gb/t27404)(加标浓度<100ng/ml，回收率范围在60-120％；100-1000ng/ml，回收率范围在80-110％)，说明本发明提取的桔霉素毒素的方法是可行的，且该方法更加简便。表4红曲酒样品d中桔霉素毒素含量检测加标浓度(ng/ml)实际含量(ng/ml)理论含量(ng/ml)回收率(％)074.3974.392000260.94274.3995.101000166.60174.3995.53500121.46124.3997.64当前第1页12