一种基于发光细菌法的土壤综合毒性检测方法与流程

本发明涉及发光细菌的综合毒性检测方法领域，具体涉及一种基于发光细菌法的土壤综合毒性检测方法。

背景技术：

土壤作为人类赖以生存的场所，含有多种污染物，如持久性有机污染物与农药、挥发性有机物和多环芳烃类有机物等。每种污染物不仅有各自的毒性，而且各种污染物质混合、相互作用也会产生潜在的毒性。现有检测技术多局限于检测单一污染物毒性，无法测定污染物的复合污染效应。因此，开展土壤的综合毒性检测工作有重要意义。

我国是农业大国，建立准确可靠、灵敏度高和符合国际标准的农田土壤污染物检测技术，从整体上提高我国农业产地环境中污染物综合毒性检测能力，为我国农产品的种植以及农田土壤的修复提供重要的理论依据以及指导意见，保证农产品的质量安全和避免国际间的贸易争端，具有非常重要的理论和实践意义。

现有检测土壤毒性的技术可以分为定量检测技术和综合毒性快速检测技术。这些方法都可以检测土壤综合毒性，有些方法通过同时检测土壤中多种农药、重金属等的含量反映土壤综合毒性，如色谱类技术、化学发光法、比色法、免疫色谱法等；有些则通过多种农药、重金属等的联合作用效果反映饮用水综合毒性，如微生物法和酶法。目前，有机磷农药的定量检测技术主要是色谱类技术，包括气相色谱法液相色谱法、超临界流体色谱法等。重金属定量检测技术包括紫外可见分光光度法、原子吸收光谱法、原子荧光光度法、电感耦合等离子体质谱法等。以上这些方法都需要昂贵的检测仪器和复杂的前处理，并且由于仪器测定条件变化与检测结果密切相关，需要非常专业的分析测试人员操作。因此，只有专业分析测试机构和研究机构的中心实验室才具备测试条件，检测样品的周期相对较长，检测过程复杂，检测成本较高，不适合抽检实践中快速和简便的需要。

技术实现要素：

解决的技术问题：针对现有技术中存在操作复杂、时间长、检测成本较高，并且局限于检测单一污染物毒性，无法测定污染物的复合污染效应等问题，本发明提供一种基于发光细菌法的土壤综合毒性检测方法，通过甲醇/乙二醇溶液浸提方法对土壤样品中的非水溶性有毒物质进行浸提，利用发光细菌法一明亮发光杆菌t3对有毒有害物质的灵敏性和较低的检测限，建立一种简便的土壤综合毒性检测方法，降低了对采样量的要求，从而能够开展土壤样品进行综合毒性的快速检测，测定土壤的综合毒性水平。

技术方案：一种基于发光细菌法的土壤综合毒性检测方法，所述方法包括以下步骤：

步骤一.对土壤样品进行预处理：在待检测土壤区域中采用随机多点取样法选取采样点，采集耕层土壤内的土样后，将土样混合均匀，置于土壤袋后在室温下阴凉处风干，去除植物残根，磨碎后于室温避光保存备用；

步骤二.样品的浸提：称取步骤一制备的土样，过尼龙筛后用甲醇索氏提取，减压旋转蒸发浓缩，加入乙二醇后将该混合物继续浓缩备用；

步骤三.浸提液的毒性检测：取培养后的发光细菌培养液，加入步骤二制备的样品浸提液、15wt.％nacl溶液和纯净水，混匀后静置，测定发光强度；

步骤四.样品毒性的表达：测量步骤三静置后混合液的发光抑制率、氯化汞当量浓度。

作为优选，所述步骤一选取5个采样点。

作为优选，所述步骤二中称取3～5g步骤一制备的土样，过2mm尼龙筛后用甲醇索氏提取16h，减压旋转蒸发浓缩至5ml，加入3～5ml乙二醇，然后将混合物继续浓缩至5ml备用。

作为优选，所述步骤三中发光细菌为明亮发光杆菌t3。

作为优选，所述步骤三培养后的发光细菌培养液、样品浸提液、15wt.％nacl溶液和纯净水的体积比为1：2：4：13。

作为优选，所述步骤三取50μl培养后的发光细菌培养液，加入100μl样品浸提液、200μl15wt.％nacl和650μl纯净水。

作为优选，所述步骤三中培养后的发光细菌培养液的制备过程如下：取培养基含酵母浸出液0.5g、胰蛋白胨0.5g、甘油0.3g、nacl3g、na2hpo40.5g、kh2po40.5g和蒸馏水100ml混合均匀，调节ph值至6.5～7.0；第一代斜面菌种在20℃温度下培养24h后，立即接入第二代斜面培养12h后备用；将上述菌龄满12h的新鲜斜面菌体接入盛有50ml培养液的三角瓶中，接种量不超过1环，20℃、210r/min振荡培养，每2h测定1次培养液发光强度。

作为优选，所述步骤三中取培养16～18h后的发光细菌培养液。

作为优选，所述步骤三中混匀后静置15min。

作为优选，所述步骤四中通过dxy-2型生物毒性测试仪检测浸提液对发光细菌的发光抑制率。

有益效果：1.本发明采用发光细菌检测法，前处理简单、成本低廉，对有毒物质的检测速度与传统毒理学方法相比较快，同时也可以对大气、水环境和食物等进行综合生物毒性评价，与色谱检测技术相比，发光细菌法是建立在细菌发光生物传感技术基础上的毒性检测技术，具有检测快速、灵敏度高、适应性强以及重复性好等优点，能够适应样品量小的物质的综合毒性检测；生物发光是发光细菌生理状况的一个反映,发光细菌在生长对数期发光能力最强。当环境条件不良或有毒物质存在时,因细菌荧光素酶活性或细胞呼吸受到抑制,其发光能力受到影响或减弱,减弱的程度与环境有毒物质毒性的大小正相关。因此本方法完全能够用于土壤综合毒性检测。

2.选择甲醇/乙二醇作为浸提液对样品中的毒性物质进行浸提，先用对毒性物质具有很好浸提效果的甲醇对样品液进行浸提。由于，甲醇对发光细菌具有强毒性，因此无法对毒性物质提取液直接进行发光度检测。需要再用对发光细菌低毒的乙二醇对毒性物质进行萃取，然后用乙二醇最终提取液进行发光度检测。

3.本方法利用发光细菌法进行检测，样品与发光细菌的反应时间短，能够迅速获得检测结果，适应大批量样品的快速检测，大大缩短了综合毒性的检测时间，提高了检测效率和准确度。

附图说明

图1为本发明所述检测方法流程图；

图2为实施例1所述土壤样品综合毒性检测结果柱状图。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本发明，并使本发明的上述优点能够更加明显易懂，下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步详细的说明。

实施例1

一种基于发光细菌法的土壤综合毒性检测方法，参照图1，所述方法包括以下步骤：

(1)对土壤样品进行预处理：严格按照环境土壤质量监测规范等相关规范流程，利用陶瓷土钻在选定的区域内采用随机多点取样法选取5个采样点，采集大于0、小于等于20cm范围内的耕层土壤，将土样混合均匀，置于布制土壤袋，防止样品中毒性物质的损失；样品经室温下阴凉处风干，去除植物残根，磨碎，以防止样品毒性物质损失和保证样品在浸提过程中和浸提液充分接触，磨碎后于室温避光保存备用。

(2)样品的浸提：称5.0g土样，过2mm尼龙筛。用甲醇索氏提取16h，用其对污染土壤进行提取后，再在提取物中加入对发光细菌低毒的乙二醇，然后通过旋转蒸发去除甲醇，以获得土壤甲醇提取物的乙二醇溶液，浸提出土壤样品中的毒性物质。对照处理用水代替乙二醇，其余条件不变。

由于土壤中的污染物多为不溶于水的物质，因此本发明利用有机溶剂对毒性物质进行抽提。以蒸馏水为对照，分别测定了甲醇、乙二醇、二氯甲烷对发光细菌的生物毒性。结果参照表1，甲醇对发光细菌具有强毒性，而乙二醇的毒性较小。但甲醇对土壤中毒性物质的抽提效率较乙二醇高，因此本发明首先采用甲醇对土壤进行抽提，然后在甲醇提取物中加入对发光细菌低毒的乙二醇，最后通过旋转蒸发去除甲醇，以获得土壤甲醇提取物的乙二醇溶液作为土壤生物测定所需的最终浸提液。

表1不同有机溶剂对明亮发光杆菌t3发光强度的影响

(3)浸提液的毒性检测:利用发光细菌法测定污染物生物毒性时可选用发光细菌冻干粉或新鲜细菌培养液。但由于发光细菌冻干粉价格昂贵(进口冻干粉约为50美元/支)，因此本实施例使用发光细菌的新鲜培养液。发光细菌培养液制备如下：取培养基含酵母浸出液0.5g、胰蛋白胨0.5g、甘油0.3g、nacl3g、na2hpo40.5g、kh2po40.5g和蒸馏水100ml混合均匀，调节ph值至6.5～7.0。第一代斜面菌种20℃培养24h后，立即接第二代斜面培养12h备用。将上述菌龄满12h的新鲜斜面菌体接入盛有50ml培养液的三角瓶中，接种量不超过1环，20℃、210r/min振荡培养，每2h测定1次培养液发光强度。具体测定方法为，取50μl培养液，加入200μl15wt.％nacl、750μl纯净水，混匀放置15min，利用dxy-2型生物毒性测试仪测定发光强度。

在本实施例培养条件下，发光细菌在前10h的培养阶段处于延滞期，不发光。进入对数生长期后发光强度迅速增加，培养20h时其发光强度趋于稳定。因此本试验采用培养16～18h的新鲜菌液进行毒性试验。

取50μl培养16h的发光细菌培养液，加入100μl样品浸提液、200μl15wt.％nacl和650μl纯净水，混匀后静置15min，利用dxy-2型生物毒性测试仪测定发光强度，平行测定3次，相对偏差不超过10％，结果取3次测定的平均值。

(4)样品毒性的表达：发光抑制率＝(对照组发光强度-样品发光强度)/对照组强度×100％，通过发光抑制率，来表征土壤的综合毒性水平。发光抑制率越大，样品浸提液的毒性越大，发光抑制率越小，样品浸提液的毒性越小。样品的发光抑制率与毒性级别关系见表2。

表2样品的发光抑制率与毒性级别关系

根据步骤(3)测定的发光强度，计算出3次平行测定的发光抑制率，计算结果参照图2，三次测定结果分别为21.8％、25.5％和25.6％，其最终的发光抑制率测定结果为24.3％，毒性等级为ⅰ级，毒性级别为微毒。

以上内容仅为本发明的较佳实施例，对于本领域的普通技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。