抗合成酶综合征EJ自身抗体的检测方法与应用与流程

本申请属于生物技术领域，涉及抗合成酶综合征ej自身抗体的检测方法与应用，具体地涉及抗合成酶综合征ej自身抗体的非放射标记免疫沉淀检测方法和免疫印迹检测方法与应用。

背景技术：

特发性炎症性肌病(idiopathicinflammatorymyopathies，iim),又称肌炎(myositis),是一组以侵害骨骼肌为主的系统性自身免疫性疾病。根据最近的诊断分类标准，iim可分为多发性肌炎(polymyositis，pm)、皮肌炎(dermatomyositis，dm)、免疫介导的坏死性肌炎(immune-mediatednecrotizingmyopathy，imnm)、非特异性肌炎(nonspecificmyositis，nsm)和包涵体肌炎(inclusionbodymyositis，sibm)。临床特点表现为四肢近端肌无力、特征性皮疹、系统性损害以及血清中存在多种自身抗体(marinosc.dalakas.inflammatorymusclediseases.nengljmed2015；372:1734-1747)。肌炎患者的自身抗体主要分为肌炎特异性自身抗体(myositisspecificautoantibodies，msas)和肌炎相关性自身抗体(myositisassociatedautoantibodies,maas)。maas多见于自身免疫性结缔组织病的重叠综合征，而msas一般仅见于肌炎患者，具有高度选择性、排他性，两种msas很少出现在同一个患者。

至今已经被鉴定的msas大约有17种，尽管目前肌炎的诊断与分类标准并不包括自身抗体的检测，但是越来越多的研究显示肌炎特异性自身抗体与肌炎患者特异的临床表现具有相关性，它们可能作为肌炎的血清标志物，辅助肌炎的诊断与疾病分型，甚至可以预测临床并发症以及对治疗的反应性(betteridgez,mchughn.myositis-specificautoantibodies:animportanttooltosupportdiagnosisofmyositis.jinternmed2016；280:8-23)。

氨基酰转运rna合成酶(aminoacyl-trnasynthetase，ars)是一类存在细胞浆的蛋白质，通过催化氨基酸连接到特异的转运rna从而参与蛋白质的合成。抗氨基酰转运rna合成酶的自身抗体，是特发性炎症性肌病中所占比例最多的一类肌炎特异性自身抗体，阳性率约为25-35％。目前已经发现8种抗合成酶自身抗体如jo-1、pl12、pl7、ej、oj、ha、ks和zo，其中抗jo-1抗体是最常见的，约在15-30％的特发性炎症性肌病患者中存在，在60-70％的间质性肺疾病患者中检测到，其余的所有抗体约在10％的特发性炎症性肌病患者中存在(mahlerm,millerfw,fritzlermj.idiopathicinflammatorymyopathiesandtheanti-synthetasesyndrome:acomprehensivereview.autoimmunrev.2014,13:367-71.)。最初的研究显示抗合成酶抗体只存在特发性炎症性肌病患者中，因此把它们归为肌炎特异性自身抗体。后来的研究发现抗合成酶抗体在其他的自身免疫结缔组织疾病中也存在，含有这类抗体的患者具有共同的特异性的临床表现，包括肌炎、间质性肺疾病、关节炎、发热、雷诺氏现象和技工手等临床表现,统称为抗合成酶综合征(anti-synthetasesyndrome)。肌肉的组织学研究也显示抗合成酶综合征是特发性炎症性肌病中独立的一个亚型。

抗ej抗体是抗合成酶抗体中的一种，靶抗原是甘氨酰转运rna合成酶(targoffin.autoantibodiestoaminoacyl-transferrnasynthetasesforisoleucineandglycine.twoadditionalsynthetasesareantigenicinmyositis.jimmunol.1990，144:1737-43.)。第一个发现ej抗体阳性的患者有雷诺氏现象、轻度的指端硬化和无力，肌酸激酶水平增高，但是没有肌活检和肌电图的检查，也不伴有间质性肺疾病。targoffin用放射免疫沉淀方法分析了637例患者(包括肌炎和其他疾病)的ej抗体，发现5例患者存在ej抗体，他们都具有肌炎、皮肌炎的典型皮疹和间质性肺疾病等临床表现。其中一个患者还诊断为系统性红斑狼疮，该患者出现肌炎之前的4个月ej抗体呈阳性(targoffin,trieuep,plotzph,millerfw.antibodiestoglycyl-transferrnasynthetaseinpatientswithmyositisandinterstitiallungdisease.arthritisrheum.1992，35:821-30.)。一个多中心的研究显示50％的ej抗体阳性的患者被诊断为皮肌炎和无肌病性皮肌炎(hamaguchiy,fujimotom,matsushitat,etal.commonanddistinctclinicalfeaturesinadultpatientswithanti-aminoacyl-trnasynthetaseantibodies:heterogeneitywithinthesyndrome.plosone2013；8:e60442)。因此ej自身抗体的检测对于肌炎的分类是非常重要的。

检测ej自身抗体的主要方法有酶联免疫吸附法(elisa)、放射标记的免疫沉淀方法、免疫印迹法，上述方法各有优缺点：(1)酶联免疫吸附法(elisa)。elisa虽然为自身抗体的检测提供敏感性高、快速、高通量且能够定量的方法，但是目前ej自身抗体尚无商业化的elisa试剂盒，自行包被抗原需要高度纯化的ej抗原(商业化购买或实验室表达纯化)，而且抗原包被的条件需要最优化，容易出现假阳性的结果；同时elisa试剂盒需要进行批量检测，对于发病率不是很高的肌炎，不适合作为临床实验室的常规检测。(2)采用商业化的免疫印迹膜条或者购买纯化的抗原蛋白进行免疫印迹,但是这些膜条对抗体滴度不能进行定量而且在国内的推广还有限。(3)免疫沉淀法是检测肌炎特异性自身抗体的金标准，一般是采用s35标记hela细胞或k562细胞，然后将待测血清与细胞裂解液进行免疫沉淀，sds聚丙烯酰胺凝胶电泳分离沉淀物，放射自显影，这是检测ej自身抗体的金标准。作为金标准的放射标记免疫沉淀法有很高的特异性和敏感性，而且这种方法沉淀的是以天然构象存在的抗原以及与靶抗原相互作用的蛋白分子，但是放射同位素只能用于装备良好的实验室，而且这种方法难以区别分子量接近的不同种类的自身抗原。

技术实现要素：

为克服上述现有技术的缺陷，解决目前国内没有商业化检测ej抗体的elisa试剂盒以及免疫印迹膜条不能测定滴度的缺陷，以及自行包被ej抗原的elisa试剂盒高成本、高假阳性率和放射标记免疫沉淀法的安全性问题，本发明的目的在于提供抗合成酶综合征ej自身抗体的非放射性检测方法，具体地包括抗合成酶综合征ej自身抗体的非放射标记免疫沉淀检测方法和免疫印迹检测方法。

本发明的目的还在于提供抗合成酶综合征ej自身抗体的上述非放射性检测方法的应用。

本发明的上述目的通过以下技术方案实现：

抗合成酶综合征ej自身抗体的非放射性检测方法，包括：抗合成酶综合征ej自身抗体的非放射标记免疫沉淀检测方法和免疫印迹检测方法。

所述的抗合成酶综合征ej自身抗体的非放射标记免疫沉淀检测方法，包括以下步骤：

(1)将带有flag标签的penter-ej质粒瞬时转染人胚肾(hek)293细胞48小时，通过westernblot法用flag抗体检测所述penter-ej质粒在所述人胚肾(hek)293细胞中的过表达；

(2)用proteing磁珠分别与20ulej抗体阳性的抗合成酶综合征患者血清或健康对照血清进行结合，然后与步骤(1)中所述过表达ej的hek293细胞裂解液孵育进行抗原吸附，洗脱后进行sds-page凝胶电泳，用所述flag抗体进行检测。

所述的抗合成酶综合征ej自身抗体的免疫印迹检测方法，包括以下步骤：

(1)将带有flag标签的penter-ej质粒瞬时转染人胚肾(hek)293细胞48小时，通过westernblot法用flag抗体检测所述penter-ej质粒在所述人胚肾(hek)293细胞中的过表达；

(2)将20ug步骤(1)中所述过表达ej的hek293细胞裂解液进行sds-page凝胶电泳，用ej抗体阳性血清作为一抗，用兔抗人iggh&l作为二抗进行检测。

所述的抗合成酶综合征ej自身抗体的非放射性检测方法的应用，用于检测肌炎患者的抗ej自身抗体。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。

图1是本申请所使用的penter-ej质粒图谱；

图2是本申请测序证实penter-ej质粒中ej序列和读码框的准确性；

图3是本发明westernblot法检测penter-ej质粒在hek293细胞的过表达；

图4是本发明采用ej抗体阳性的抗合成酶综合征患者血清和健康对照血清与过表达ej的hek293细胞裂解液进行免疫沉淀，westernblot检测沉淀的ej蛋白，从而证实抗合成酶综合征患者血清中ej抗体能够识别hek293细胞中的含flag标签的ej；

图5是本发明将过表达ej的hek293细胞裂解液进行sds-page凝胶电泳，用ej抗体阳性血清作为一抗，用兔抗人iggh&l作为二抗进行检测，证实ej抗体阳性血清能够识别hek293细胞中的带有flag标签的ej；

图6是本发明的非放射标记免疫沉淀方法筛选肌炎患者血清中的ej抗体，im为肌炎。

具体实施方式

以下将配合附图及实施例来详细说明本申请的实施方式，借此对本申请如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

实施例1抗合成酶综合征ej自身抗体的非放射标记免疫沉淀检测方法

1、材料

penter-ej质粒(维真生物公司，ch810182)

flag抗体(sigma-aldrich公司，f1804)

pureproteomeproteing磁珠(millipore公司，lskmagg10)

2、方法

抗合成酶综合征ej自身抗体的非放射标记免疫沉淀检测方法，包括以下步骤：

(1)将带有flag标签的penter-ej质粒(如附图1所示)进行测序，证实ej序列和读码框的准确性(如附图2所示)；

(2)将2ugpenter-ej、4ugpenter-ej分别瞬时转染人胚肾(hek)293细胞48小时，sds裂解液裂解hek293细胞，进行sds-page凝胶电泳和转膜，采用flag抗体进行孵育，发现转染penter-ej质粒的hek293细胞中有约为75kda的特异性条带(如附图3所示)，以上结果提示penter-ej质粒能在hek293细胞中过表达，表达的蛋白质约为75kda的带有flag标签的ej；

(3)取50ulproteing磁珠悬液分别与20ulej抗体阳性的抗合成酶综合征患者血清或健康对照血清于4℃持续混匀16h以捕获抗体，反应后用500μlpbs(含0.1％20)洗涤上述磁珠3-5次，加入200ug过表达ej的hek293细胞裂解液，并用含1％蛋白酶抑制剂的ripa裂解液补足体积至500ul，室温下旋转混匀1-2小时进行抗原吸附；重复上述清洗磁珠步骤3-5次，向其中加入40μl1×sds-pageloadingbuffer混合均匀，95℃加热10min，立即收集上清液至新的ep管；然后将上述样品于10％sds-page电泳后转移至pvdf膜上，加入flag抗体杂交，ecl化学发光，证实抗合成酶综合征患者血清的ej抗体能够特异性地将hek293细胞中过表达的带flag标签的ej沉淀(如附图4所示)。

实施例2抗合成酶综合征ej自身抗体的免疫印迹检测方法

1、材料

penter-ej质粒(维真生物公司，ch810182)

flag抗体(sigma-aldrich公司，f1804)

ej抗体阳性血清(1:1000稀释)

兔抗人iggh&l(1:5000，abcam公司，ab6759))

2、方法

抗合成酶综合征ej自身抗体的免疫印迹检测方法，包括以下步骤：

(1)将2ugpenter-ej，4ugpenter-ej分别瞬时转染hek293细胞48小时，sds裂解液裂解hek293细胞，进行sds-page凝胶电泳和转膜，采用flag抗体进行孵育，发现转染penter-ej质粒的hek293细胞中有约为75kda的特异性条带(如附图3所示)，以上结果提示penter-ej质粒能在hek293细胞中过表达，表达的蛋白质约为75kda的带有flag标签的ej；

(2)将30ug和60ug过表达ej的hek293细胞裂解液或未转染penter-ej的hek293细胞裂解液进行sds-page凝胶电泳并转移至pvdf膜上，用ej抗体阳性血清作为一抗4℃孵育过夜，用兔抗人iggh&l作为二抗室温孵育1h，ecl化学发光，发现ej抗体阳性血清能够特异性识别未转染penter-ej质粒的hek293细胞中约75kda的蛋白质，说明ej这种合成酶在hek293细胞有内源性表达；同时ej抗体阳性血清也能够特异性识别带有flag标签的ej(如附图5所示)。

实施例3检测200例肌炎患者血清的ej抗体的阳性率

肌炎患者血清的ej抗体的阳性率，包括以下步骤：

(1)接种30％hek293细胞于75cm2的细胞培养皿，37℃培养小于24小时；

(2)将20ugpenter-ej质粒转染hek293细胞48小时；

(3)采用1ml含蛋白酶抑制剂的ripa裂解液裂解hek293细胞，蛋白进行定量；

(4)采用flag抗体证实hek293细胞中过表达的ej；

(5)取20ul炎性肌病患者待测血清、阳性血清、阴性血清分别与200ug过表达ej的细胞裂解液进行免疫沉淀，进行sds-page凝胶电泳，然后用flag抗体进行检测，确定ej抗体在肌炎患者中的阳性率约为1.5％(如附图6所示)。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。