一种龙眼叶片中黄酮类物质的检测方法与流程

本发明涉及生化检测，特别涉及一种龙眼叶片中黄酮类物质的检测方法。
背景技术：
：黄酮类化合物是高等植物产生的重要的次生代谢物，具有多种多样的生物功能。它们为花、果实和种子提供色素，保护植物免受紫外线的损伤，抵御病菌、昆虫和一些草食动物的侵袭，诱导植物根部与共生菌相互作用，调节生长素运输，影响花粉育性等。同时，黄酮类化合物又具有多种保健与药用功能，如清除自由基、抗氧化、抗癌、消炎、抗病毒、发挥植物雌激素样活性、保护心血管系统和肝脏、抑制酒精嗜好症、防止骨质疏松等功能。龙眼的黄酮类物质在果核、果肉、叶片等组织中均有发现。现代研究表明龙眼具有抗衰老、抗癌、抗焦虑、抗氧化等多方面的生物活性功能。龙眼中具有抗氧化能力的物质主要为多酚、黄酮类。研究表明，不同的栽培品种其果实的黄酮类物质含量差异显著，我们在前期的研究中发现，不同品种间，龙眼叶片中的类黄酮物质合成途径中关键基因的表达调控存在显著差异。但是，造成不同品种龙眼果实黄酮类物质含量显著差异的原因仍然不清楚。在龙眼的花、果肉、果皮、果核、体胚含有黄酮类物质如芦丁和棚皮素等，但未见龙眼叶片的芦丁和棚皮素含量的研究，而不同品种间的差异也尚不清楚。技术实现要素：为此，需要提供一种对龙眼叶进行黄酮类物质检测的检测方法。为实现上述目的，为实现上述目的，发明人提供了一种龙眼叶片中黄酮类物质的检测方法，具体步骤如下：样品制备：称取1g龙眼叶片样品，在液氮中磨成粉状后，置于离心管中，加入1.5～1.7ml60％～65％的甲醇和0.3～0.5ml6mol/l的盐酸，90℃水浴55～65min，冷却至20～25℃后，再加入1.5～3ml100％甲醇，超声震荡3～6min，7000～8000rpm离心15～20min，取上清液用0.22μm微孔滤膜过滤，存于样品瓶中准备进样；绘制标准曲线：分别精确称取黄酮类物质的标准品，以样品为溶剂，定容至25ml，配置5个不同浓度，浓度区间从5ug/ml至100ug/ml的标准品溶液，hplc中测定峰面积，采用最小二乘法绘制回归方程，根据相关系数计算标准溶液的线性范围；hplc的检测条件如下：agilenteclipseplus-c18-2.1×100mm，柱温为30℃，流动相为乙腈和0.2％磷酸，流速1.0ml/min；检测波长280nm；进样量20μl；样品hplc检测：检测条件同绘制标准曲线步骤；计算含量：采用外标-标准曲线法，计算样品龙眼叶片中黄酮类物质的含量。进一步的，一种龙眼叶片中黄酮类物质的检测方法，具体步骤如下：样品制备：称取1g龙眼叶片样品，置于液氮中磨成粉状后，放入离心管中，加入1.6ml62.5％甲醇和0.4ml6mhcl，90℃水浴60min，冷却至25℃后再加入2ml100％甲醇，超声震荡5min，8000rpm离心15min，取上清液用0.22μm微孔滤膜过滤，存于样品瓶中准备进样；绘制标准曲线：分别精确称取绿原酸、芦丁和槲皮素标准品，以样品为溶剂，定容至25ml，配置浓度为5，10，20，40，100ug/ml的标准品溶液，hplc中测定峰面积，采用最小二乘法绘制回归方程，根据相关系数计算标准溶液的线性范围；hplc检测：检测条件如下：agilenteclipseplus-c18-2.1×100mm，柱温为30℃，流动相为乙腈和0.2％磷酸，流速1.0ml/min；检测波长280nm；进样量20μl；样品hplc检测：检测条件同绘制标准曲线步骤；计算含量：采用外标-标准曲线法，计算龙眼叶片中绿原酸、芦丁和槲皮素的含量。用绿原酸、芦丁和槲皮素标准品色谱峰保留时间定性，峰面积定量，计算龙眼叶片中绿原酸、芦丁和槲皮素的含量。进一步地，所述流动相乙腈和0.2％磷酸的体积比为20:80。进一步地，所述龙眼叶片于4月份采集新梢嫩叶，液氮速冻，置于-80℃冰箱中保存。区别于现有技术，上述技术方案用hplc方法对龙眼叶片中的绿原酸、芦丁和槲皮素的含量进行了分析，对龙眼叶片里的黄酮类物质进行了系统性分析，填补了此项的国内技术空白。附图说明图1为绿原酸、芦丁和槲皮素标准品hplc图谱；图2为“立冬本”龙眼叶片绿原酸、芦丁和槲皮素hplc图谱；图3为“松本风”龙眼叶片绿原酸、芦丁和槲皮素hplc图谱；图4为“石硖”龙眼叶片绿原酸、芦丁和槲皮素hplc图谱；图5为“东宝9号”龙眼叶片绿原酸、芦丁和槲皮素hplc图谱。具体实施方式本实施方式中所述的黄酮类物质是一类存在于自然界的、具有2-苯基色原酮结构的化合物。它们分子中有一个酮式羰基，第一位上的氧原子具碱性，能与强酸成盐，其羟基衍生物多具黄色，故又称黄碱素或黄酮。黄酮类物质在植物体中通常与糖结合成苷类，小部分以游离态(苷元)的形式存在。绝大多数植物体内都含有黄酮类化合物，它在植物的生长、发育、开花、结果以及抗菌防病等方面起着重要的作用。黄酮类物质分为5个亚类：黄酮、黄烷醇、总黄酮、黄酮醇、和花青盐。本实施方式中所述的绿原酸，是由咖啡酸与奎尼酸生成的缩酚酸，是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素类化合物。本实施方式中所述的芦丁是一类包括槲皮素和二糖芸香糖的糖苷，槲皮素是一种黄酮苷元，由芦丁经β-芦丁氧化酶(β-rutinosidase)催化形成，β-芦丁氧化酶存在于细菌和植物中。为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。实施例1、绿原酸、芦丁和槲皮素线性回归方程的确定：hplc(仪器agilen1260)检测条件为：c18色谱柱(agilenteclipseplus，2.1×100mm，i.d)，柱温为40℃，流动相为乙腈：0.2％磷酸(20：80)，流速1.0ml/min；检测波长280nm；进样量20μl。试验标准品绿原酸、芦丁和槲皮素购于sigma公司分别精确称取绿原酸、芦丁和槲皮素标准品，为了避免杂质干扰，以品种为“立冬本”的龙眼叶片提取液为溶剂，定容至25ml，配置浓度为5，10，20，40，100ug/ml的标准品溶液，加入仪器中测定峰面积，采用最小二乘法绘制回归方程，根据相关系数计算标准溶液的线性范围。请参阅图1，绿原酸、芦丁和槲皮素标准品hplc图谱；图谱显示，绿原酸、芦丁和槲皮素三种标准样品在本技术方案hplc条件下能很好的分离。根据图谱，完成绿原酸、芦丁和槲皮素标准方程如下表所示：分析物质标准方程线性范围相关系数(r)芦丁y＝78956.8x20.00-500μg/ml0.996槲皮素y＝68521.10x5.00-200μg/ml0.999绿原酸y＝101245.07x1.00-100μg/ml0.999经过发明者的试验研究，确认了绿原酸、芦丁和槲皮素在线性范围内，上机浓度(x)分别与色谱峰面积(y)有良好的线性关系。精密度试验：用hplc在相同条件下对3种类黄酮混合标准品溶液连续平行测定6次，检测其保留时间与峰面积，统计分析后计算相对标准偏差，考察仪器精密度。精密度试验结果表明，通过对标样的连续6次测定，计算得峰面积的rsd为0.6％，精密度较好。重复性试验：对供试样品进行重复性实验，计算得峰面积的rsd为0.8％，有较好的重复性。稳定性试验：稳定性结果表明，供试样品溶液在12h内稳定。实施例2：选取品种为“立冬本”的龙眼叶片，于4月份采集新梢嫩叶，液氮速冻，置于-80℃冰箱中保存备用。1、样品制备：称取1g叶片样品，置于液氮中磨成粉状，转入10ml的离心管中，加入1.6ml62.5％甲醇和0.4ml6mhcl，90℃水浴60min，置于冰上冷却后至20℃后加入2ml100％甲醇，超声震荡5min，8000rpm离心15min取上清用0.22μm微孔滤膜过滤至色谱瓶中用于hplc分析。2、样品hplc检测：用实施例1相同的色谱条件测定，结果请参阅图2，“立冬本”龙眼叶片绿原酸、芦丁和槲皮素hplc图谱，得出绿原酸、芦丁和槲皮素色谱峰面积，代入表1的标准方程，求得品种为“立冬本”的龙眼叶片中绿原酸、芦丁和槲皮素的含量分别为23.2μg/g，366.3μg/g，129.1μg/g。实施例3：选取品种为“松风本”的龙眼叶片，按实施例2的步骤进行检测，得出品种为“松风本”的龙眼叶片中绿原酸、芦丁和槲皮素的含量分别为33.2μg/g，259.9μg/g，69.6μg/g。实施例4：选取品种为“石硖”的龙眼叶片，按实施例2的步骤进行检测，得出品种为“石硖”的龙眼叶片中绿原酸、芦丁和槲皮素的含量分别为45.8μg/g，236.5μg/g，131.8μg/g。实施例5：选取品种为“冬宝9号”的龙眼叶片，按实施例2的步骤进行检测，得出品种为“冬宝9号”的龙眼叶片中绿原酸、芦丁和槲皮素的含量分别为14.6μg/g，341.6μg/g，253.1μg/g。不同龙眼品种叶片中黄酮类物质的含量如下表所示：本发明利用hplc测定了不同龙眼品种叶片中的绿原酸、芦丁和槲皮素含量，发现不同品种间的含量差异较大，其中，‘石硖’品种的绿原酸含量最高，‘冬宝9号’品种的槲皮素含量最高，而‘立冬本’品种的芦丁含量最高。需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者终端设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者终端设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括……”或“包含……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者终端设备中还存在另外的要素。此外，在本文中，“大于”、“小于”、“超过”等理解为不包括本数；“以上”、“以下”、“以内”等理解为包括本数。尽管已经对上述各实施例进行了描述，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改，所以以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利保护范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的
技术领域：
，均同理包括在本发明的专利保护范围之内。当前第1页12